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背景类风湿关节炎(rheumatoid arthritis, RA)是一种慢性炎症性自身免疫病。特征为关节滑膜病变、骨质侵蚀[1-2]。此病致残率较高,严重影响患者的生活质量。艾灸作为传统中医护理技术之一,对改善RA的临床症状具有疗效较好、毒副作用小等特点,但其具体作用机制尚未阐明,更未见蛋白质组学的相关报道。目的应用蛋白质组学双向凝胶电泳和质谱技术寻找并鉴定艾灸治疗RA模型大鼠滑膜组织的蛋白质表达变化,探讨治疗机制,为临床运用艾灸治疗RA提供现代医学证据。方法(1)建立胶原诱导性关节炎(Collgen-Induced-Arthritis,CIA)模型大鼠。模型成功后随机分为6组,艾灸Ⅰ组,艾灸Ⅱ组,艾灸Ⅲ组,模型Ⅰ组,模型Ⅱ组,模型Ⅲ组,每组各6只雄性SD大鼠。艾灸组选取双侧足三里、肾俞穴温和灸治疗。Ⅰ组干预1周,Ⅱ组干预2周,Ⅲ组干预3周。模型组不予治疗。另设正常雄性SD大鼠18只随机分为正常Ⅲ组,正常Ⅱ组,正常Ⅲ组,每组6只。(2)基线比较：比较各组大鼠造模前体重、足趾肿胀度。(3)比较艾灸Ⅲ组、模型Ⅲ组、正常Ⅲ组艾灸干预3周后大鼠一般情况。(4)比较艾灸Ⅲ组、模型Ⅲ组、正常Ⅲ组干预前、干预1周、2周、3周大鼠体重、足趾肿胀情况。(5)比较艾灸Ⅲ组、模型Ⅲ组干预前、干预1周、2周、3周关节炎指数积分。(6)收集艾灸Ⅲ组、模型Ⅲ组、正常Ⅲ组干预3周后大鼠滑膜组织标本,HE染色法观察病理形态改变。(7)干预1周、2周、3周收集9组大鼠滑膜组织标本,双向电泳。软件分析比对各时间点艾灸组、模型组、正常组。选取各时间点模型组与艾灸组的共同差异蛋白点作为艾灸治疗的差异蛋白点。应用MALDI-TOF MS鉴定差异蛋白点。搜索NCBI数据库确定差异蛋白,并应用Ingenuity Pathway Analysis (IPA)软件分析差异蛋白参与的生物功能、信号通路及信号网络等。结果(1)各组大鼠造模前体重、足趾肿胀度差异无统计学意义(P>0.05),具有可比性。(23周后,正常Ⅲ组大鼠表现正常,模型Ⅲ组大鼠饮食、活动减少,关节强直,艾灸Ⅲ组大鼠饮食、活动及关节强直情况有所改善。(3)艾灸Ⅲ组、模型Ⅲ组各时间点大鼠的体重、足趾肿胀与正常Ⅲ组比较差异有统计学意义(P<0.05),两组体重较正常Ⅲ组减轻,足趾肿胀较正常Ⅲ组加重。艾灸Ⅲ组在体重恢复、改善足趾肿胀方面较模型Ⅲ组有优势,但差异无统计学意义(P>0.05)。(4)艾灸Ⅲ组、模型Ⅲ组干预前关节炎指数积分均大于4分,干预后各时间点艾灸Ⅲ组较模型Ⅲ组有改善趋势,但差异无统计学意义(P>0.05)。(5)干预3周后,正常Ⅲ组大鼠滑膜HE染色正常。模型Ⅲ组可见明显滑膜增生、炎性浸润。艾灸Ⅲ组滑膜变薄,炎症减轻。(6)各组大鼠关节滑膜双向电泳图谱清晰,蛋白点分离完全。每张凝胶图谱辨识(1316.7±24.7)个蛋白点,组内蛋白点平均匹配率90%-93%。模型组与艾灸组第1、2、3周差异蛋白点分别为365个、332个和202个。三个时间点共同表达差异蛋白点9个。经质谱分析及NCBI数据库检索,9个差异蛋白点都匹配到相应蛋白质,生物功能主要涉及器官形态、骨骼肌肉功能、免疫功能、炎性反应和疾病、血液系统功能、结缔组织功能等。(7)IPA分析发现：艾灸主要通过调节过氧化物还原酶I (PRDX Ⅰ)、3-羟酰基-辅酶A脱氢酶(EHHADH)、肌球蛋白轻链3(MLC3)、血红素结合蛋白(HPX)等蛋白并分别经由NRF2-介导的氧化应激反应通路(NRF2-mediated Oxidative Stress Response)、脂肪酸β-氧化通路Ⅲ(Fatty Acidβ-oxidation Ⅲ)、急性期反应通路(Acute Phase Response Signaling)、细胞骨架肌动蛋白通路(Acin Cytoskeleton Signaling)、上皮细胞黏附通路(Epithelial Adherens Junction Signaling)等,从而参与功能涉及DNA复制、重组和修复,细胞集结和炎性反应的信号网络,最终调控本研究中RA的发生与发展。结论(1)本实验中,艾灸可改善CIA模型大鼠饮食等一般活动情况,且三个疗程后病理切片显示轻度滑膜细胞肿胀及少量炎性细胞浸润,说明艾灸具有一定的抗炎免疫作用,但足部红肿情况在短时间难以改善。(2)鉴定了艾灸持续干预RA的9个差异表达蛋白质,提示艾灸可调节RA大鼠滑膜组织多种蛋白质表达。主要通过调节PRDX Ⅰ、EHHADH、MLC3、HPX等蛋白并经由NRF2-mediated Oxidative Stress Response、Fatty Acidp-oxidation Ⅲ、Acute Phase Response Signaling、Acin Cytoskeleton Signaling、Epithelial Adherens Junction Signaling等通路,从而参与功能涉及DNA复制、重组和修复,细胞集结和炎性反应的信号网络,最终调控本研究中RA的发生与发展。