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目的：
基于VDR/RXR/FGF23信号通路探讨肾元颗粒对db/db小鼠骨代谢作用的机制，为中医药防治DKD骨代谢异常提供理论基础。
方法：
体内实验采用db/db小鼠配合高磷饮食构建DKD小鼠模型，将30只db/db小鼠随机分为模型组（db/db+蒸馏水）、肾元颗粒低剂量组（db/db+SYG1.5g/kg， db/db+SYG-L）和肾元颗粒高剂量组（db/db+SYG6g/kg，db/db+SYG-H），每组10只，给予1.2%高磷饲料。另用10只db/m小鼠作为对照组（db/m+蒸馏水），给予0.2%正常磷含量饲料。各组小鼠每日给药1次，连续给药12周。药物干预期间观察各组小鼠体重、饮水、摄食、毛发及反应状态等生命体征，并记录其空腹血糖（FBG）的变化。于药物干预的第12周收集各组小鼠24h尿液，检测尿微量白蛋白（mALB）和尿肌酐（UCr），计算尿白蛋白肌酐比值（UACR）。12周药物干预结束后，用10%水合氯醛麻醉收集各组小鼠的血液、肾脏和骨骼等标本。检测其血清肌酐（SCr）、尿素氮（BUN）、钙（Ca）、磷（Pi）、甲状旁腺激素（PTH）、1,25(OH)2D3（1,25D）、成纤维生长因子23（FGF23）和Klotho的含量。采用HE、PAS和Masson染色观察各组小鼠肾脏病理形态的改变，采用 HE、TRAP、Von Kossa和 Goldner`s三色法染色观察各组小鼠骨组织病理形态的改变。通过Micro CT检测骨微结构和骨组织形态计量学的改变。通过 Real-Time PCR、Western Blot和免疫组化检测各组小鼠骨组织中ALP、OC和CTSK骨代谢标志分子的表达，及FGF23、VDR和RXR的表达，免疫荧光双标检测各组小鼠骨组织中VDR/RXR的共表达。
体外实验采用成骨细胞UMR-106，首先观察高糖环境对UMR-106细胞活力和FGF23表达的影响，分别用5.5mmol/L、10mmol/L、20mmol/L和30mmol/L浓度的葡萄糖干预UMR-106细胞，通过CCK-8法分别检测各组细胞的活力，Real-Time PCR和 Western Blot检测细胞 FGF23的表达。然后观察在高糖和非高糖环境下1,25D对UMR-106细胞FGF23表达的影响，分别于高糖环境和非高糖环境（30mmol/L）下向UMR-106细胞中添加0.1nmol、1nmol和10nmol的1,25D，通过 Real-Time PCR和WesternBlot检测各组细胞FGF23的表达，筛选合适浓度的1,25D用于后续实验。观察肾元颗粒含药血清对UMR-106细胞VDR/RXR/FGF23信号通路的影响。先制备肾元颗粒含药血清，给予 Wistar大鼠（n=15）2.72g/kg肾元颗粒灌胃，对照组（n=15）给予等体积蒸馏水，每日2次，连续7天，于第7天末次灌胃1h后收集两组大鼠血液，经离心、灭活、过滤和分装后备用，经课题组前期高效液相色谱质谱联用测得血清中主要含有淫羊藿苷、黄芪甲苷和大黄素等药效成分。通过 CCK-8法筛选出合适的肾元颗粒含药血清浓度用于后续实验。将UMR-106细胞分为对照组、高糖组、高渗组、1,25D组和肾元颗粒组，通过 Real-Time PCR和Western Blot检测各组细胞VDR、RXR和FGF23的表达，免疫荧光双标检测各组细胞VDR/RXR的共表达。
结果：
1.肾元颗粒对db/db小鼠一般状况和肾脏结构功能的影响。①一般状况：与对照组比较，模型组小鼠的体重、进食量、饮水量和 FBG均明显增加（P＜0.01），并出现体型肥胖、颈部背侧毛发脱落、伤口愈合延迟、活动频率降低和反应迟钝等表现。与模型组比较，肾元颗粒组小鼠的体重、进食量、饮水量和FBG均无显著差异（P﹥0.05），但其未出现毛发脱落，且反应较灵敏。②肾功能：与对照组比较，模型组小鼠血清SCr、BUN、Pi、PTH、1,25D和FGF23的含量明显升高（P＜0.01），血清Ca的含量降低（P＜0.01）。与模型组相比，肾元颗粒干预后db/db小鼠血清 SCr、BUN、Pi、PTH、1,25D和 FGF23的水平均降低（P＜0.05或P＜0.01），血清Ca的含量升高，差异具有统计学意义（P＜0.05）。③尿白蛋白肌酐比值：与对照组比较，模型组小鼠 mALB含量显著升高（P＜0.01），而 UCr水平显著降低（P＜0.01），导致尿白蛋白肌酐比值(UACR)显著增加（P＜0.01），肾元颗粒干预后 db/db小鼠 mALB含量降低（P＜0.05），使得 UACR也明显降低（P＜0.05）。④肾脏形态结构：与对照组比较，模型组小鼠出现肾小球面积增大、系膜基质增生、纤维化面积增加，差异具有统计学意义（P＜0.01），还伴随肾小管的管腔扩张和刷状缘脱落。肾元颗粒干预后，db/db小鼠的肾小球面积、系膜基质和纤维化面积呈不同程度的减小（P＜0.05或 P＜0.01），而且肾小管的损伤也有所减轻。
2.肾元颗粒对db/db小鼠骨组织形态结构的影响。①骨微结构和骨形态计量学：与对照组相比，模型组小鼠骨量明显丢失，松质骨的骨体积分数（BV/TV）、骨小梁数量（Tb.N）、骨小梁厚度（Tb.Th）和骨密度（BMD）均显著降低（P＜0.01），而骨小梁分离度（Tb.Sp）和结构模型指数（SMI）均增加（ P＜0.01）。肾元颗粒干预使db/db小鼠的BV/TV、Tb.N、Tb.Th和BMD（P＜0.05或P＜0.01）增加，并降低Tb.Sp和 SMI（P＜0.05或 P＜0.01）。②骨组织形态结构：与对照组小鼠相比，模型组小鼠股骨远端干骺端松质骨的骨体积明显降低，骨小梁数量减少、厚度变薄、分布稀疏、连接减少，骨髓腔中充满大量的脂肪细胞，填充于骨小梁之间，皮质骨中出现广泛的侵蚀样空洞。此外，模型组小鼠股骨远端骨组织中破骨细胞标记区域和骨中钙盐沉积均明显降低，同时伴有骨小梁的矿化功能的损害。与模型组相比，肾元颗粒干预使db/db小鼠的骨小梁数量、厚度、分布和连接增多，骨髓腔中脂肪细胞的数量减少，并且破骨细胞标记区域面积、钙盐沉积和矿化功能均有不同程度的改善。
3.肾元颗粒对db/db小鼠骨代谢的影响。与对照组相比，模型组小鼠骨组织中 ALP和 OC mRNA与蛋白的表达均显著上调（P＜0.05），而CTSK mRNA与蛋白的表达则显著降低（P＜0.05）。经肾元颗粒干预， db/db小鼠骨组织中ALP、OC的表达降低（P＜0.05），而CTSK的表达升高（P＜0.05），改善db/db小鼠的骨代谢功能。
4.肾元颗粒对db/db小鼠骨组织VDR/RXR/FGF23信号通路的影响。与对照组比较，模型组小鼠骨组织中 FGF23、VDR和 RXR的表达均显著上调（P＜0.01），免疫荧光双标显示 VDR/RXR的共表达增加。而肾元颗粒干预使db/db小鼠骨组织中FGF23、VDR和RXR的表达降低（P＜0.05），并降低骨组织中VDR/RXR的共表达。
5.高糖环境对UMR-106细胞活力及FGF23表达的影响。与对照组相比，正常浓度葡萄糖（5.5mmol/L）环境并不会改变 UMR-106细胞的活力和FGF23的表达，而高浓度葡萄糖（30mmol/L）环境则明显降低细胞的活力，并抑制其FGF23的表达（P＜0.05）。
6.1,25(OH)2D3对高糖环境下UMR-106细胞FGF23表达的影响。在非高糖环境下，1,25D以浓度依赖的方式上调细胞中 FGF23的表达，当用10nmol1,25D干预时细胞 FGF23的表达显著升高（P＜0.01）。与对照空白组相比，高糖环境使UMR-106细胞FGF23的表达显著降低（P＜0.05），但10nmol1,25D依然会使高糖环境下该细胞 FGF23的表达升高（P＜0.05）。
7.肾元颗粒含药血清对高糖环境下UMR-106细胞VDR/RXR/FGF23信号通路的影响。CCK-8法显示10%浓度的肾元颗粒含药血清对 UMR-106细胞的活力无明显影响，故选择此浓度进行后续实验。与对照组相比，高糖组细胞FGF23、VDR和RXRmRNA与蛋白的表达显著降低（P＜0.05），而且细胞中VDR/RXR的共表达也下降。与对照组相比，高渗组细胞中 FGF23、VDR和 RXR的表达均无明显差异。与高糖组比较，1,25D组细胞 FGF23、VDR和 RXR的表达均显著上调（P＜0.05），且细胞中VDR/RXR的共表达也显著升高。而与1,25D组比较，用肾元颗粒含药血清干预会使细胞 FGF23、VDR和 RXR的表达均下调（ P＜0.05），且VDR/RXR的共表达也降低。
结论：
1.db/db小鼠联合高磷饮食动物模型表现出肾脏结构功能受损和钙磷代谢紊乱，肾元颗粒可以改善db/db小鼠的肾功能和钙磷水平，并缓解其肾脏病理改变；
2.db/db小鼠的骨微结构、骨形态计量参数和骨病理形态等均出现损害。肾元颗粒可以改善db/db小鼠骨量的丢失、骨骼微结构的破坏和骨重塑的异常，发挥改善其骨骼质量和强度的作用；
3.肾元颗粒可以改善 db/db小鼠骨代谢异常并抑制其骨骼中 FGF23的表达，其机制可能与肾元颗粒调节骨组织中 VDR/RXR/FGF23信号通路有关。
4.本研究初步从肾-骨轴探讨了 DKD骨代谢异常的机制，在一定程度上拓展了肾主骨理论的科学内涵及应用。
基于VDR/RXR/FGF23信号通路探讨肾元颗粒对db/db小鼠骨代谢作用的机制，为中医药防治DKD骨代谢异常提供理论基础。
方法：
体内实验采用db/db小鼠配合高磷饮食构建DKD小鼠模型，将30只db/db小鼠随机分为模型组（db/db+蒸馏水）、肾元颗粒低剂量组（db/db+SYG1.5g/kg， db/db+SYG-L）和肾元颗粒高剂量组（db/db+SYG6g/kg，db/db+SYG-H），每组10只，给予1.2%高磷饲料。另用10只db/m小鼠作为对照组（db/m+蒸馏水），给予0.2%正常磷含量饲料。各组小鼠每日给药1次，连续给药12周。药物干预期间观察各组小鼠体重、饮水、摄食、毛发及反应状态等生命体征，并记录其空腹血糖（FBG）的变化。于药物干预的第12周收集各组小鼠24h尿液，检测尿微量白蛋白（mALB）和尿肌酐（UCr），计算尿白蛋白肌酐比值（UACR）。12周药物干预结束后，用10%水合氯醛麻醉收集各组小鼠的血液、肾脏和骨骼等标本。检测其血清肌酐（SCr）、尿素氮（BUN）、钙（Ca）、磷（Pi）、甲状旁腺激素（PTH）、1,25(OH)2D3（1,25D）、成纤维生长因子23（FGF23）和Klotho的含量。采用HE、PAS和Masson染色观察各组小鼠肾脏病理形态的改变，采用 HE、TRAP、Von Kossa和 Goldner`s三色法染色观察各组小鼠骨组织病理形态的改变。通过Micro CT检测骨微结构和骨组织形态计量学的改变。通过 Real-Time PCR、Western Blot和免疫组化检测各组小鼠骨组织中ALP、OC和CTSK骨代谢标志分子的表达，及FGF23、VDR和RXR的表达，免疫荧光双标检测各组小鼠骨组织中VDR/RXR的共表达。
体外实验采用成骨细胞UMR-106，首先观察高糖环境对UMR-106细胞活力和FGF23表达的影响，分别用5.5mmol/L、10mmol/L、20mmol/L和30mmol/L浓度的葡萄糖干预UMR-106细胞，通过CCK-8法分别检测各组细胞的活力，Real-Time PCR和 Western Blot检测细胞 FGF23的表达。然后观察在高糖和非高糖环境下1,25D对UMR-106细胞FGF23表达的影响，分别于高糖环境和非高糖环境（30mmol/L）下向UMR-106细胞中添加0.1nmol、1nmol和10nmol的1,25D，通过 Real-Time PCR和WesternBlot检测各组细胞FGF23的表达，筛选合适浓度的1,25D用于后续实验。观察肾元颗粒含药血清对UMR-106细胞VDR/RXR/FGF23信号通路的影响。先制备肾元颗粒含药血清，给予 Wistar大鼠（n=15）2.72g/kg肾元颗粒灌胃，对照组（n=15）给予等体积蒸馏水，每日2次，连续7天，于第7天末次灌胃1h后收集两组大鼠血液，经离心、灭活、过滤和分装后备用，经课题组前期高效液相色谱质谱联用测得血清中主要含有淫羊藿苷、黄芪甲苷和大黄素等药效成分。通过 CCK-8法筛选出合适的肾元颗粒含药血清浓度用于后续实验。将UMR-106细胞分为对照组、高糖组、高渗组、1,25D组和肾元颗粒组，通过 Real-Time PCR和Western Blot检测各组细胞VDR、RXR和FGF23的表达，免疫荧光双标检测各组细胞VDR/RXR的共表达。
结果：
1.肾元颗粒对db/db小鼠一般状况和肾脏结构功能的影响。①一般状况：与对照组比较，模型组小鼠的体重、进食量、饮水量和 FBG均明显增加（P＜0.01），并出现体型肥胖、颈部背侧毛发脱落、伤口愈合延迟、活动频率降低和反应迟钝等表现。与模型组比较，肾元颗粒组小鼠的体重、进食量、饮水量和FBG均无显著差异（P﹥0.05），但其未出现毛发脱落，且反应较灵敏。②肾功能：与对照组比较，模型组小鼠血清SCr、BUN、Pi、PTH、1,25D和FGF23的含量明显升高（P＜0.01），血清Ca的含量降低（P＜0.01）。与模型组相比，肾元颗粒干预后db/db小鼠血清 SCr、BUN、Pi、PTH、1,25D和 FGF23的水平均降低（P＜0.05或P＜0.01），血清Ca的含量升高，差异具有统计学意义（P＜0.05）。③尿白蛋白肌酐比值：与对照组比较，模型组小鼠 mALB含量显著升高（P＜0.01），而 UCr水平显著降低（P＜0.01），导致尿白蛋白肌酐比值(UACR)显著增加（P＜0.01），肾元颗粒干预后 db/db小鼠 mALB含量降低（P＜0.05），使得 UACR也明显降低（P＜0.05）。④肾脏形态结构：与对照组比较，模型组小鼠出现肾小球面积增大、系膜基质增生、纤维化面积增加，差异具有统计学意义（P＜0.01），还伴随肾小管的管腔扩张和刷状缘脱落。肾元颗粒干预后，db/db小鼠的肾小球面积、系膜基质和纤维化面积呈不同程度的减小（P＜0.05或 P＜0.01），而且肾小管的损伤也有所减轻。
2.肾元颗粒对db/db小鼠骨组织形态结构的影响。①骨微结构和骨形态计量学：与对照组相比，模型组小鼠骨量明显丢失，松质骨的骨体积分数（BV/TV）、骨小梁数量（Tb.N）、骨小梁厚度（Tb.Th）和骨密度（BMD）均显著降低（P＜0.01），而骨小梁分离度（Tb.Sp）和结构模型指数（SMI）均增加（ P＜0.01）。肾元颗粒干预使db/db小鼠的BV/TV、Tb.N、Tb.Th和BMD（P＜0.05或P＜0.01）增加，并降低Tb.Sp和 SMI（P＜0.05或 P＜0.01）。②骨组织形态结构：与对照组小鼠相比，模型组小鼠股骨远端干骺端松质骨的骨体积明显降低，骨小梁数量减少、厚度变薄、分布稀疏、连接减少，骨髓腔中充满大量的脂肪细胞，填充于骨小梁之间，皮质骨中出现广泛的侵蚀样空洞。此外，模型组小鼠股骨远端骨组织中破骨细胞标记区域和骨中钙盐沉积均明显降低，同时伴有骨小梁的矿化功能的损害。与模型组相比，肾元颗粒干预使db/db小鼠的骨小梁数量、厚度、分布和连接增多，骨髓腔中脂肪细胞的数量减少，并且破骨细胞标记区域面积、钙盐沉积和矿化功能均有不同程度的改善。
3.肾元颗粒对db/db小鼠骨代谢的影响。与对照组相比，模型组小鼠骨组织中 ALP和 OC mRNA与蛋白的表达均显著上调（P＜0.05），而CTSK mRNA与蛋白的表达则显著降低（P＜0.05）。经肾元颗粒干预， db/db小鼠骨组织中ALP、OC的表达降低（P＜0.05），而CTSK的表达升高（P＜0.05），改善db/db小鼠的骨代谢功能。
4.肾元颗粒对db/db小鼠骨组织VDR/RXR/FGF23信号通路的影响。与对照组比较，模型组小鼠骨组织中 FGF23、VDR和 RXR的表达均显著上调（P＜0.01），免疫荧光双标显示 VDR/RXR的共表达增加。而肾元颗粒干预使db/db小鼠骨组织中FGF23、VDR和RXR的表达降低（P＜0.05），并降低骨组织中VDR/RXR的共表达。
5.高糖环境对UMR-106细胞活力及FGF23表达的影响。与对照组相比，正常浓度葡萄糖（5.5mmol/L）环境并不会改变 UMR-106细胞的活力和FGF23的表达，而高浓度葡萄糖（30mmol/L）环境则明显降低细胞的活力，并抑制其FGF23的表达（P＜0.05）。
6.1,25(OH)2D3对高糖环境下UMR-106细胞FGF23表达的影响。在非高糖环境下，1,25D以浓度依赖的方式上调细胞中 FGF23的表达，当用10nmol1,25D干预时细胞 FGF23的表达显著升高（P＜0.01）。与对照空白组相比，高糖环境使UMR-106细胞FGF23的表达显著降低（P＜0.05），但10nmol1,25D依然会使高糖环境下该细胞 FGF23的表达升高（P＜0.05）。
7.肾元颗粒含药血清对高糖环境下UMR-106细胞VDR/RXR/FGF23信号通路的影响。CCK-8法显示10%浓度的肾元颗粒含药血清对 UMR-106细胞的活力无明显影响，故选择此浓度进行后续实验。与对照组相比，高糖组细胞FGF23、VDR和RXRmRNA与蛋白的表达显著降低（P＜0.05），而且细胞中VDR/RXR的共表达也下降。与对照组相比，高渗组细胞中 FGF23、VDR和 RXR的表达均无明显差异。与高糖组比较，1,25D组细胞 FGF23、VDR和 RXR的表达均显著上调（P＜0.05），且细胞中VDR/RXR的共表达也显著升高。而与1,25D组比较，用肾元颗粒含药血清干预会使细胞 FGF23、VDR和 RXR的表达均下调（ P＜0.05），且VDR/RXR的共表达也降低。
结论：
1.db/db小鼠联合高磷饮食动物模型表现出肾脏结构功能受损和钙磷代谢紊乱，肾元颗粒可以改善db/db小鼠的肾功能和钙磷水平，并缓解其肾脏病理改变；
2.db/db小鼠的骨微结构、骨形态计量参数和骨病理形态等均出现损害。肾元颗粒可以改善db/db小鼠骨量的丢失、骨骼微结构的破坏和骨重塑的异常，发挥改善其骨骼质量和强度的作用；
3.肾元颗粒可以改善 db/db小鼠骨代谢异常并抑制其骨骼中 FGF23的表达，其机制可能与肾元颗粒调节骨组织中 VDR/RXR/FGF23信号通路有关。
4.本研究初步从肾-骨轴探讨了 DKD骨代谢异常的机制，在一定程度上拓展了肾主骨理论的科学内涵及应用。