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干扰素(interferons, IFNs)是一种可诱导细胞因子的多基因家族,其主要作用是抵抗病毒感染的免疫防御以及抗增殖和免疫调节作用,作为生物药剂和疫苗佐剂具有广阔的应用前景。为了更好的探讨基因工程技术来开发重组鹅IFN-α制剂的可能性,本研究将去除信号肽的鹅α干扰素基因置于毕赤酵母α因子分泌信号肽后,构建能分泌表达goIFN-α蛋白的重组表达质粒pPICZaA-goIFN-α,将其转化到毕赤酵母宿主菌X33中,实现了其在毕赤酵母中的高效表达。并采用微量细胞病变抑制法分析研究了goIFN-α生物活性,为进一步的研究与开发鹅干扰素类制剂打下基础。其主要结果如下：1、根据NCBI上本课题组已提交的天府肉鹅基因序列(序列号为HQ115583),设计并合成一对引物,应用PCR技术从含有天府肉鹅IFN-α完整基因的重组质粒pMD18-T-goIFN-α中扩增鹅α干扰素的成熟肽基因。PCR产物经纯化回收后,克隆到pMD18-T载体上。将DNA序列测定正确的克隆质粒pMDT-IFNa用EcoRⅠ和XbaⅠ双酶切后与同样经EcoRⅠ和XbcⅠ双酶切的pPICZαA连接过夜,转化大肠杆菌感受态DH5a,得到重组表达质粒pPICZaA-goIFN-a,并对重组表达质粒进行PCR鉴定、酶切鉴定以及序列测定。2.将验证正确的重组表达质粒用sacⅠ进行单酶切,采用电转化法将线性化的重组质粒电穿孔导入毕赤酵母宿主菌X33,涂布YPDS+Zeocin选择性培养基,置30。C温箱培养3-5天,结果获得多个白色的菌落。分别挑选生长良好的3株不同的白色单菌落,先用BMGY培养基激活培养,离心后用BMMY培养基重悬菌体,每隔24小时添加1%的甲醇进行诱导表达72小时后,离心收集菌液。冻干法浓缩后的菌液,经斑点杂交筛选出高拷贝的转化子。将筛选出的高拷贝菌落重新进行诱导表达,并用Elisa法确定最佳的表达时间和甲醇浓度。重组子经最佳表达方法诱导表达后,离心收集菌液,用TCA浓缩后的蛋白,进行SDS-PAGE和Western-blotting分析,结果表明分泌于胞外的鹅IFN-α蛋白分子量大约为22 kDa,比理论值(18.7 kDa)略大,估计是表达产物在表达过程中发生一定的糖基化所致。3.采用微量细胞病变抑制法评价了表达的重组鹅IFN-α的抗病毒活性。制备鹅胚成纤维细胞,采用TCID50法测定VSV病毒株的鹅胚成纤维细胞的半数感染量。表达的蛋白经透析、过滤除菌处理后,分析研究其生物活性,结果显示鹅IFN-α对水泡型口炎病毒在鹅胚成纤维细胞中可起抑制作用,抗病毒活性为1.79×103U/ml。综上所述,本研究成功的克隆了天府肉鹅干扰素-α基因,成功构建了鹅IFN-α的真核表达质粒,实现了其在毕赤酵母中的高效表达,表达产物并具有明显的抗病毒活性。