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第一部分FcRL5的表达及FcRL5 CAR-T细胞的制备目的:检测FcRL5在多发性骨髓瘤（Multiple myeloma,MM）患者的原代骨髓瘤细胞、多发性骨髓瘤细胞株、B细胞淋巴瘤细胞株和正常人原代T细胞、B细胞和NK细胞以及CD34+造血干/祖细胞（hematopoietic stem/progenitor cells,HPCs）中的表达;构建靶向FcRL5的一代CAR（不含共刺激结构域）和二代CAR（包含CD28共刺激结构域）的慢病毒表达载体;制备相对应的FcRL5 CAR-T细胞。方法:（1）用Ficoll分离液从正常人外周血和MM患者骨髓液分别分离外周血单个核细胞（Peripheral blood mononuclear cell,PBMC）和骨髓单个核细胞（Bone morrow mononuclear cell,BMMC）,复苏、培养多发性骨髓瘤细胞株,用流式细胞术检测各种细胞表面FcRL5或BCMA的表达。（2）通过分子克隆技术构建anti-FcRL5 CAR的慢病毒表达载体,通过与病毒包装质粒共转染制备表达anti-FcRL5 CAR的慢病毒上清。（3）利用抗人CD3和抗CD28抗体从PBMCs中激活并扩增出T细胞,再用表达anti-FcRL5 CAR的慢病毒上清感染T细胞获取FcRL5 CAR-T细胞,通过流式细胞术检测FcRL5 CAR-T细胞表面嵌合抗原受体（Chimeric antigen receptor,CAR）结构的表达。结果:（1）收集了23例多发性骨髓瘤患者的骨髓标本,并检测了这些标本中CD138+骨髓瘤细胞表面FcRL5和BCMA的表达情况,发现FcRL5表达阳性细胞百分比和平均荧光强度（Mean fluorescence intensity,MFI）均比BCMA高。同时发现有8例MM患者骨髓瘤细胞的BCMA表达水平很低（阳性细胞百分比低于5%）,而FcRL5明显高表达。（2）在所检测的多发性骨髓瘤细胞株中,NCI-H929细胞为FcRL5高表达,而RPMI-8226、MM.1s和MM.1R细胞均不表达或显著低表达FcRL5。成功构建了稳定过表达FcRL5的多发性骨髓瘤细胞株MM.1s-FcRL5和表达空载的MM.1s-Ev细胞株。（3）文献报道部分淋巴瘤细胞也表达FcRL5,于是检测了6种淋巴瘤细胞表面FcRL5的表达情况,其中Mino和Farage细胞为FcRL5高表达,DOHH2、Daudi、TMD8和JEKO细胞均为FcRL5低表达。（4）在正常人原代细胞中,B细胞表面部分表达FcRL5,T细胞、NK细胞和HPCs细胞均为FcRL5阴性表达。（5）成功构建一代和二代anti-FcRL5 CAR的慢病毒表达载体,并制备出相应的FcRL5 CAR-T细胞,通过流式细胞术检测证实FcRL5 CAR-T细胞表面能够成功表达CAR结构。结论:FcRL5在大多数MM患者骨髓瘤细胞表面高表达,而不在正常人原代T细胞、NK细胞以及HPCs等重要细胞表面表达,提示FcRL5也许可以作为CAR-T细胞治疗MM的有效靶点。第二部分FcRL5 CAR-T细胞的表型及效应功能测试目的:测试FcRL5 CAR-T细胞的表型特征和体外抗肿瘤效应;比较BCMA CAR-T细胞与FcRL5 CAR-T细胞的体外功能差异;通过引入分子开关进一步提高FcRL5CAR-T细胞的安全性。方法:（1）建立CAR-T细胞和靶细胞的共培养体系,从以下几个方面测试FcRL5CAR-T细胞的表型和体外抗肿瘤效应:流式细胞术检测T细胞表面活化标志物CD107a和CD69的表达;利用细胞毒性实验测试对靶细胞的杀伤效应;免疫酶联吸附试验（Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）法检测共培养上清中细胞因子的分泌;流式细胞术检测效应细胞中颗粒酶B的表达;e Fluor670活细胞染料标记效应细胞后用流式细胞术检测其增殖情况等。（2）构建稳定过表达FcRL5的293T-FcRL5细胞及感染空载体慢病毒的293T-Ev细胞,从效应细胞的杀伤、细胞因子分泌和增殖情况等方面,在体外判断FcRL5 CAR-T细胞对FcRL5靶点反应的特异性。（3）制备MM患者的FcRL5-28z T细胞并与其对应的自体CD138+骨髓瘤细胞共同培养,通过ELISA法检测效应细胞的IFN-γ分泌情况和利用绝对计数法检测其杀伤效应。（4）制备BCMA-28z T细胞,体外比较BCMA-28z T细胞与FcRL5-28z T细胞在杀伤、细胞因子分泌和增殖方面的差异。（5）通过ELISA法检测FcRL5 CAR-T细胞分别与正常人原代T细胞、B细胞、NK细胞和CD34+造血干/祖细胞等重要细胞共同培养后上清中IFN-γ的分泌情况。（6）构建i C9-FcRL5-28z CAR的慢病毒表达载体,制备i C9-FcRL5-28z T细胞。经小分子二聚化诱导药物AP1903处理24小时后,检测i C9-FcRL5-28z T细胞的凋亡及其杀伤效应变化情况。结果:（1）FcRL5阳性表达的多发性骨髓瘤细胞株NCI-H929和MM.1s-FcRL5以及淋巴瘤细胞株Mino能够在体外有效刺激FcRL5 CAR-T细胞的活化、增殖和杀伤,并促进其细胞因子分泌和颗粒酶B的表达。（2）与空载T细胞相比,FcRL5CAR-T细胞与293T-FcRL5细胞共同培养后细胞因子的分泌、增殖和杀伤效应均明显升高;空载T细胞和FcRL5 CAR-T细胞分别与293T-Ev细胞共培养后,其细胞因子分泌、增殖和杀伤效应方面均没有显著差异。（3）收集到的3例MM患者骨髓标本中,CD138+骨髓瘤细胞均为FcRL5高表达,并且能够有效刺激自体FcRL5-28z T细胞IFN-γ的分泌和杀伤效应。（4）在效应细胞/靶细胞（E/T）比值较低时,FcRL5-28z T细胞的杀伤能力高于BCMA-28z T细胞。但二者在细胞因子分泌、增殖能力以及E/T比较高时的杀伤能力方面均没有明显差异。（5）与空载T细胞相比,FcRL5-28z T细胞与正常人原代B细胞共培养后上清中IFN-γ的分泌大量增加,而与T细胞、NK细胞和HPCs细胞分别共培养后IFN-γ的分泌均没有明显变化。（6）小分子二聚化诱导药物AP1903能够有效诱导i C9-FcRL5-28z T细胞发生凋亡从而阻断其杀伤效应。结论:FcRL5 CAR-T细胞能够在体外有效且以抗原表达依赖性模式识别和杀伤患者来源的原代骨髓瘤细胞、骨髓瘤细胞株和B细胞淋巴瘤细胞株。分子开关的引入可以有效提高FcRL5 CAR-T细胞的安全性。本研究为临床测试应用靶向FcRL5的CAR-T细胞治疗FcRL5阳性表达的多发性骨髓瘤和B细胞淋巴瘤提供了理论依据。