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背景:扩张型心肌病（Dilated Cardiomyopathy,DCM）是导致心力衰竭的主要病因之一[1-2],属原发性混合型心肌病的一种,猝死率高,5年病死率为15%～50%[3]。其病因复杂多变,包括:病毒感染、免疫异常、基因突变、酒精中毒、围产期、抗肿瘤药物和代谢异常等。这些不同病因作用于心脏并导致心室扩张、心肌收缩和舒张受限的机理目前尚不清楚,目前缺乏针对性的治疗,治疗主要集中在抗心衰、抗心律失常及抗凝等对症治疗,而中医对该病的治疗在改善心功能、缓解临床症状及提高生存率等方面有一定的优势[4]。课题组前期临床研究提示扩心方可明显改善扩心病患者心功能及临床症状,提高患者生活质量[5];扩心方能改善阿霉素诱导的扩张型心肌病大鼠心肌肥大、坏死,减少心肌纤维化,具体作用机制有待深入研究[6]。心脏淋巴管的生理病理作用一直未引起人们的重视[7];目前扩张型心肌病与心脏淋巴管新生关系的报道十分罕见,机制未能阐明。我们前期研究发现,阿霉素诱导的大鼠DCM模型出现明显的心脏淋巴管新生障碍,显示模型组心肌淋巴管标志物心外膜淋巴管较正常组明显减少,而运用中药扩心方治疗能够有效逆转,呈现剂量依赖性,但机制不清。课题组进一步采用与DCM表型相似的Tnnt突变斑马鱼模型,用扩心方对其进行治疗发现可以改善Tnnt突变斑马鱼生存率[8];筛选扩心方的君药黄芪,发现其有效成分黄芪多糖对Tnnt突变斑马鱼（扩张型心肌病表型）同样具有治疗作用,作用机制与扩心方相似。在前期工作基础上,本课题拟研究扩心方及其有效成分黄芪多糖对淋巴管新生的调控作用机制。目的:利用网络药理学研究扩心方防治扩张型心肌病的作用机制,筛选出DCM心脏淋巴管新生有效作用通路或相关基因;利用Tg（Fli1a:EGFP;Gata1:Ds Red）转基因斑马鱼分别构建正常斑马鱼淋巴管模型、化学剂MAZ51诱导的斑马鱼淋巴管损伤模型两种模型,用于研究扩心方对斑马鱼淋巴管生理及病理情况的调控作用机制;利用RNA-Seq研究分析扩心方有效成分黄芪多糖对Tnnt斑马鱼的具体作用机制,筛选出有效通路或作用基因,探讨其对淋巴管新生的作用机制。方法:1.采用网络药理学方法研究扩心方防治DCM潜在的靶点及作用通路。中药系统药理学分析平台（TCMSP）检索并筛选出扩心方有效化学成分及相关靶点,筛选标准:口服生物利用度（OB）≥30%,药物相似性（DL）≥0.18,小肠上皮细胞通透性（Caco2）≥0.4。Uniprot数据库将预测出的靶点蛋白名转换为相关基因名。Genecards.org数据库检索与DCM相关的基因,将有效化合物靶点与DCM靶点运用R语言进行统计分析,获得药物-靶点网络,并且绘制药物靶点网络图。Cytoscape3.7.2软件根据药物及疾病靶点的交集绘制疾病靶点PPI网络图。Bioconductor数据库对筛选所得基因进行GO功能及KEGG通路富集分析,绘制富集基因气泡图及相关通路图。2.在进行斑马鱼毒性实验、研究扩心方药效浓度的基础上,根据毒性实验明确扩心方的可使用浓度范围。构建Tg（Fli1a:EGFP;Gata1:Ds Red）转基因斑马鱼淋巴管模型,分别应用扩心方对正常斑马鱼淋巴管模型、血管内皮生长因子3受体激酶抑制剂MAZ51诱导的斑马鱼淋巴管损伤模型进行干预,在荧光显微镜下观察斑马鱼淋巴管的生长情况并拍照统计,同时采用RT-PCR法来检测相关淋巴管因子VEGF-C、VEGF-A、PROX1、LYVE-1的m RNA水平的变化,以此来观察扩心方对Tg（Fli1a:EGFP;Gata1:Ds Red）转基因斑马鱼正常及损伤状态下淋巴管新生的作用。3.采用高通量测序方法对经黄芪多糖处理的斑马鱼幼鱼中提取的总RNA转录后所得c DNA文库进行测序。定量分析过程中读取序列时可获得RNA转录物。HISAT快速将转录本定位到参考基因组中,Bowtie 2软件把clean reads与新转录本中的基因参考序列（包含所有转录本的碱基序列）进行比对,RSEM对基因及转录本的表达水平进行计算及后续的差异表达分析。最后利用R软件中的phyper函数对差异表达基因进行GO功能和KEGG通路富集分析,制作富集分析图及相关通路图。结果:1.网络药理学研究发现,经筛选后,扩心方有106种有效成分,1217个相关靶点,3405个DCM相关靶点,其中,扩心方与DCM的共同靶点58个。GO分析得到1578个富集基因,KEGG分析得到132条信号通路。本研究初步发现扩心方可以通过PI3K-AKT信号通路、IL-17信号通路、HIF-1信号通路、TNF信号通路等调节淋巴管新生。靶点方面,扩心方可以通过VEGF-A、IL6、MMP9、MAPK1、CCL2、CASP3、IL1B、EGFR、NOS3、CXCL8、FOS、STAT3、IL10、MMP2、MYC、ICAM1、PPARG、SPP1、SERPINE1、MAPK14等基因起到防治DCM的作用。其中VEGF-A、STAT1/STAT3、IL1B/IL2/IL4/IL6/CXCL8/IL10、CCL2、EGFR、ERBB2/ERBB3、FOS、VCAM1、ICAM1、IGF2等基因已被证实可以调控淋巴管新生,这些基因为后期淋巴管新生研究提供了依据。2.经过斑马鱼毒性实验发现扩心方的安全浓度是小于或等于45μg/m L,故本研究采用45μg/m L作为最大浓度;在正常斑马鱼淋巴管模型中,观察统计后发现扩心方对斑马鱼的淋巴管新生具有促进作用（P＜0.05）,可以提高淋巴管相关基因VEGF-C、VEGF-A的m RNA表达水平（P＜0.05）,对PROX1、LYVE-1的m RNA表达水平无显著影响（P＞0.05）;在MAZ51抑制所致的斑马鱼淋巴管损伤模型中,扩心方同样具有促淋巴管新生的作用（P＜0.05）,在该模型中,扩心方同样可以提高淋巴管相关基因VEGF-C、VEGF-A的m RNA表达水平,对PROX1、LYVE-1的m RNA表达水平无显著影响（P＞0.05）。3.前期研究发现扩心方君药黄芪的有效成分之一黄芪多糖,对Tnnt突变斑马鱼的心脏具有保护作用。基于RNA-Seq发现,DOX组与DOX15组相比,差异表达基因一共有127个,其中差异基因表达上调的有64个,差异表达基因下调有63个。Tnnt组与Tnnt15组相比,差异表达基因一共有116个,其中差异基因表达上调的有82个,差异表达基因下调有34个。对两个实验组的差异进行比对分析后发现具有关注价值的是:IL6r、FOSb、FOSL1a、CADM2b、CADM2a、CCL19b等。经KEGG分析后,黄芪多糖对Tnnt2a突变斑马鱼的心脏保护作用的作用机制可能与剪接体、内质网蛋白加工、MAPK信号通路、Notch信号通路、Hedgehog信号通路、雌激素信号通路等信号通路有关。而这些相关作用通路中与淋巴管新生相关的信号通路有:MAPK信号通路、细胞黏附分子信号通路、PI3K/AKT信号通路。结论:1.网络药理学研究发现,扩心方可能通过PI3K-AKT信号通路、IL-17信号通路、HIF-1信号通路、TNF信号通路等通路及VEGF-A、STAT1/STAT3、IL1B/IL2/IL4/IL6/CXCL8/IL10、CCL2、EGFR、ERBB2/ERBB3、FOS、VCAM1、ICAM1、IGF2等基因调控DCM淋巴管新生。2.在正常斑马鱼淋巴管模型及斑马鱼淋巴管损伤模型中,扩心方均具有促淋巴管新生的作用（P＜0.05）,且扩心方在两种模型中都可以提高VEGF-C、VEGF-A的m RNA表达水平（P＜0.05）,提示在两种模型中其作用机制均可能是通过刺激淋巴管中VEGF-C、VEGF-A的表达进而促进体内淋巴管新生。3.RNA-Seq研究结果提示:扩心方君药黄芪有效成分黄芪多糖对Tnnt2a斑马鱼DCM淋巴管新生的作用机制可能与IL6r、FOSb、FOSL1a、CADM2b、CADM2a、CCL19等基因及MAPK信号通路、细胞黏附分子信号通路、PI3K/AKT信号通路、TNF信号通路密切相关。