研究背景膀胱癌是常见的威胁人类健康的泌尿系统恶性肿瘤,肌层浸润性膀胱癌危害尤甚。目前对浸润性膀胱癌最有效的治疗是采用根治性全膀胱切除,但是在根治术后2年内约有50%的患者会发生复发、转移,并最终死于膀胱肿瘤。膀胱癌术后容易复发、转移的原因可能是膀胱癌的“肿瘤干细胞”没有被清除或消灭。近年来的研究表明,肿瘤干细胞在维持肿瘤的恶性增殖、侵袭、转移、复发和耐药等方面中起着决定性作用。虽然肿瘤干细胞在肿瘤组织中所占比例很少,在放化疗时,大部分非肿瘤干细胞可被轻而易举地杀死,但是占肿瘤组织比例很少的肿瘤干细胞却具有顽强的抵抗力和增生力,自我复制出一代又一代的新生肿瘤细胞,结果导致肿瘤细胞不断复发、转移。所以,理想的治疗方法应该是在杀死非肿瘤干细胞的同时,能特异地、选择性地、靶向性地杀死肿瘤干细胞。只有彻底杀灭或清除肿瘤干细胞才有可能治愈肿瘤。肿瘤疫苗是通过多种方式将肿瘤抗原接种宿主体内以获得主动免疫反应,产生抗肿瘤的作用。为增强肿瘤细胞的免疫源性,具有增强免疫活性的细胞因子被广泛应用,如粒细胞-巨细胞集落刺激因子,它是由B细胞、T细胞、巨噬细胞等在细胞因子或炎症刺激下产生,可显著促进造血细胞的增殖分化,促进其分泌IL-2、TNF、INF等细胞因子,更重要的是,可促进树突状细胞成熟,促进抗原的有效递呈,从而有效地激活免疫反应。经过这种锚定细胞因子的肿瘤疫苗治疗后的小鼠,外周血中的CD4+T和CD8+T淋巴细胞明显增多,肿瘤组织中浸润性淋巴细胞也明显增多,能有效地诱导机体产生特异性抗肿瘤免疫,肿瘤细胞很大程度被杀灭,皮下肿瘤体积明显减小,小鼠的生存时间明显延长。但是我们在研究中也发现,无论是选用何种细胞因子,不管是单独、联合或序贯地运用这种锚定细胞因子的肿瘤细胞疫苗,仍然会有一部分小鼠的肿瘤在消退一段时间后又会再次生长,这一点符合肿瘤干细胞学说的观点。我们在前期制备的疫苗并不是肿瘤干细胞疫苗,并没有激发机体产生针对肿瘤干细胞的特异性免疫反应,不能彻底杀灭肿瘤干细胞。因此,本实验在前期研究的基础上,进一步分离出膀胱癌干细胞,在细胞水平上运用我们特有的蛋白质锚定技术制备膀胱癌干细胞疫苗,促进机体产生针对膀胱癌干细胞的特异性免疫反应,有效地杀伤或清除膀胱癌干细胞,为今后治疗和预防膀胱癌的复发和转移奠定基础。本研究分四部分展开：第一部分：膀胱癌干细胞的分离1、研究目的从MB49膀胱癌细胞株中分离获得MB49膀胱癌干细胞。2、研究方法(1)筛选最佳无血清培养基(2)有限稀释法(3)无血清培养法进行传代3、研究结果(1)筛选得到最佳无血清培养基即RPMI1640+EGF(20ng/ml)+bFGF(20ng/ml)+LIF(20ng/ml)+B27(20μl/ml)+BSA(4μg/ml).(2)只有2-3%的MB49膀胱癌细胞能形成克隆球,即MB49膀胱癌干细胞MCSCs.这个结果符合肿瘤干细胞只占肿瘤组织比例很少的理论假设。(3)细胞形态经过多次传代后并无变化,从形态学上证明MCSCs具有稳定性。4、研究结论通过联合运用最佳无血清培养基与有限稀释法,从MB49膀胱癌细胞株中分离获得MB49膀胱癌干细胞。第二部分：膀胱癌干细胞的鉴定1、研究目的对MB49膀胱癌干细胞进行肿瘤干细胞的功能鉴定。2、研究方法(1)检测膀胱癌干细胞的表面标志物,运用流式细胞术、实时定量基因扩增荧光检测系统(qPCR)、Western蛋白免疫印迹(WB)检测CD133、CD44、OCT4、 NANOG和ABCG2。(2)检测膀胱癌干细胞的分化能力。(3)膀胱癌干细胞功能学方面比较,包括体外细胞增殖能力(CCK8实验),体外细胞软琼脂克隆形成能力,体外细胞侵袭性能力(Transwell小室实验),体外细胞对化疗药物的耐受能力和体内细胞成瘤实验。(4)统计学分析：用统计分析软件SPSS19.0进行数据分析,计量资料均以均数±标准差(x±s)表示,采用完全随机设计成组t检验。3、研究结果(1)流式细胞术结果显示CD133+CD44+的比例在MCSCs是19.83±0.68%,要显著高于MB49cells的3.57±0.38%,二者之间具有统计学意义(t=36.173,P=O.000)。(2)WB结果显示OCT4, NANOG和ABCG2的蛋白含量在MCSCs要显著高于MB49cells,二者之间具有统计学意义(OCT4t=2.894, P=0.044; NANOG t=14.148, P=0.000; ABCG2t=21.866, P=O.000).(3) qPCR结果显示CD133, CD44,OCT4和NANOG的mRNA含量在MCSCs要显著高于MB49cells,二者之间具有统计学意义(CD133t=18.941, P=0.000; CD44t=-16.854, P=0.000; OCT4t=15.226,P=0.000; NANOG t=12.445, P=0.000)(4) MCSCs在无血清培养基中,呈克隆球样悬浮生长。当把MCSCs培养基中添加10%的胎牛血清后,无法继续保持未分化状态,在形态上分化成贴壁细胞,与常规在含血清培养环境中贴壁培养的MB49cells相似。(5)CCK8实验增殖曲线显示,在培养的第4,5,6天,MCSCs要显著高于MB49cells,二者之间具有统计学意义(F=582.368, P=0.000)。MCSCs表现出更强的增殖能力。(6)软琼脂克隆实验结果显示,MCSCs所形成的克隆球形态要显著大于MB49cells所形成的克隆球,形成的克隆球数目要显著多于MB49cells所形成的克隆球,二者之间具有统计学意义(t=33.732,P=0.000)。MCSCs表现出更强的增殖能力。(7) Transwell小室实验结果显示,MCSCs穿过Transwell小室的细胞数目要显著多于MB49cells穿过小室的细胞数,二者之间具有统计学意义(t=-11.654,P=0.000)。MCSCs表现出更强的侵袭能力。(8) Paclitaxel对膀胱癌细胞和膀胱癌干细胞均有杀灭作用。Paclitaxel浓度为100nM,1uM,10uM时, MCSCs细胞存活率高于MB49cells,二者之间具有统计学意义(F=1753.923, P=0.000).MCSCs对Paclitaxel表现出更强的抵抗能力。(9)相类似于paclitaxel, MCSCs对cisplatin、mitomycin、doxorubicin表现出更强的抵抗能力(F=1870.563, P=0.000; F=26460.000,P=0.000; F=371.314,P=0.000)。(10)裸鼠实验结果瘤体曲线显示,在第4,6,8周时MCSCs要显著大于MB49cells,二者之间具有统计学意义(F-288.012, P=O.000)。MCSCs对裸鼠表现出更强的致瘤能力。(11)断颈处死小鼠后,注射部位组织切片HE染色显示组织结构相似,均为膀胱癌组织。4、研究结论通过从表面标志物、分化能力,功能鉴定比较后,MB49膀胱癌干细胞具有肿瘤干细胞的特点。第三部分：肿瘤干细胞疫苗的制备及其生物学活性的检测1、研究目的制备SA-GM-CSF的MB49膀胱癌干细胞疫苗,并对GM-CSF的锚定效率和生物学活性进行检测。2、研究方法(1) SA-GM-CSF和SA-GFP双功能融合蛋白的制备(2) SA-GM-CSF膜表面修饰的MB49膀胱癌干细胞疫苗的制备(3)流式检测SA-GM-CSF对MB49膀胱癌干细胞的锚定效果(4)锚定于MB49膀胱癌干细胞表面的SA-GM-CSF的生物学活性分析(5)统计学分析：用统计分析软件SPSS19.0进行数据分析,计量资料均以均数±标准差(x±s)表示,采用完全随机设计成组t检验；双功能融合蛋白实验比较,采用单因素重复测量的方差分析。3、研究结果(1) SA-GM-CSF融合蛋白能高效地锚定在生物素化的MB49膀胱癌干细胞表面,锚定率高达89.5±1.5%。(2)锚定于膀胱癌干细胞表面的SA-GM-CSF双功能融合蛋白仍具有促进小鼠骨髓细胞的增殖活性(F=1546.522,P=0.000),且呈剂量依赖关系。4、研究结论成功制备了SA-GM-CSF膜表面修饰的MB49膀胱癌干细胞疫苗,为下一步的动物实验奠定了基础。第四部分：动物实验1、研究目的评价MB49膀胱癌干细胞对转移性膀胱癌的治疗作用。2、研究方法(1) C57BL/6小鼠膀胱癌干细胞转移模型的建立,包括皮下模型和肺转移模型。(2)运用SA-GM-CSF膜修饰的MB49膀胱癌干细胞疫苗的预防性实验。(3)运用SA-GM-CSF膜修饰的MB49膀胱癌干细胞疫苗的治疗性实验。(4)特异性毒性T淋巴细胞反应(CTL)的检测。(5)流式检测脾脏中成熟型树突状细胞(DC)的比例。(6)流式检测外周血中CD4+. CD8+T淋巴细胞的含量。(7)运用SA-GM-CSF膜修饰的MB49膀胱癌干细胞疫苗的记忆性免疫实验。(8)运用SA-GM-CSF膜修饰的MB49膀胱癌干细胞疫苗的特异性免疫实验。(9)统计学分析：用统计分析软件SPSS19.0进行数据分析,小鼠生存时间数据,采用生存分析,用Log Rank方法进行检验；对于多个独立样本的均数比较,采用单因素方差分析,方差齐性检验,如果方差齐性时,采用LSD方法进行组间两两比较,如果方差不齐,用WELCH检验,然后用DunnettT3方法进行组间两两比较；小鼠肿瘤体积的均数比较,采用重复测量的分差分析；小鼠脾细胞CTL毒性实验比较,采用析因设计的方差分析。3、研究结果(1)预防性实验结果显示：在肺模型组中,五组总体相比,运用SA-GM-CSF膜修饰的灭活MB49膀胱癌干细胞疫苗组的小鼠的生存时间延长,具有显著性差异(χ2=39.656,P=0.000)；在皮下模型组中,五组总体相比,运用SA-GM-CSF膜修饰的灭活MB49膀胱癌干细胞疫苗组的小鼠的皮下成瘤体积小,具有显著性差异(F=311.723,P=0.000)。(2)治疗性实验结果显示：在肺模型组中,五组总体相比,运用SA-GM-CSF膜修饰的灭活MB49膀胱癌干细胞疫苗组的小鼠的生存时间延长,具有显著性差异(χ2=42.591,P=0.000)；在皮下模型组中,五组总体相比,运用SA-GM-CSF膜修饰的灭活MB49膀胱癌干细胞疫苗组的小鼠的皮下成瘤体积小,具有显著性差异(F=81.825,P=0.000)。(3)特异性毒性T淋巴细胞反应实验结果显示：在肺模型组中,各实验组的淋巴细胞对MB49膀胱癌干细胞的特异性杀伤毒性实验具有显著性差异,F=6505.314,P=-0.000。不同效靶比之间也具有显著性差异,F=2523.911,P=0.000。效靶比与组间之间有交互作用,F=558.965,P=0.000。在皮下模型组中,各实验组的淋巴细胞对MB49膀胱癌干细胞的特异性杀伤毒性实验具有显著性差异,F=2147.442,P=0.000。不同效靶比之间也具有显著性差异,F=1387.245,P=0.000。效靶比与组间之间有交互作用,F=280.000,P=0.000。运用SA-GM-CSF膜修饰的灭活MB49膀胱癌干细胞疫苗组的淋巴细胞对MB49膀胱癌干细胞的杀伤活性与其它各组相比具有显著性差异,其均数显著高于其余各组。(4)流式检测成熟型DC的结果显示：在皮下模型组和肺模型组中,五组总体相比,运用SA-GM-CSF膜修饰的灭活MB49膀胱癌干细胞疫苗组的CDlle+CD80+DC细胞的含量高,具有显著性差异(肺模型组F=333.398,P=0.000；皮下模型组F=277.693,P=0.000)。(5)流式检测CD4+T.CD8+T淋巴细胞的结果显示：在皮下模型组和肺模型组中,五组总体相比,运用SA-GM-CSF膜修饰的灭活MB49膀胱癌干细胞疫苗组的CD4T.CD8+T淋巴细胞所占比例均高,具有显著性差异(肺模型组CD4+T：F=582.514,P=0.000；CD8+T:F=154.142,P=0.000；皮下模型组CD4+T:F=248.893, P=0.000；CD8+T:F=70.438,P=0.000).(6)免疫记忆实验结果显示：实验组与对照组相比,运用SA-GM-CSF膜修饰的灭活MB49膀胱癌干细胞疫苗组的小鼠的生存时间延长,具有显著性差异(χ2=26.800,P=0.000)。(7)免疫特异性实验结果显示：实验组与对照组相比,两组肿瘤体积的差异具有统计学意义(F=6009.684,P=0.000)。在第50天,两者的肿瘤体积的统计分析结果证实：两者相比具有显著性差异,对照组肿瘤体积均数显著大于实验组(F=1037.441,P=0.000)。4、研究结论(1)运用SA-GM-CSF膜修饰的MB49膀胱癌干细胞疫苗可显著增强疫苗的免疫原性,有效地激活机体的抗肿瘤免疫反应。(2)运用SA-GM-CSF膜修饰的MB49膀胱癌干细胞疫苗可有效地诱导机体产生肿瘤特异性免疫反应,抑制和杀伤肿瘤细胞,从而产生最大的抗肿瘤的免疫学效应。(3)运用SA-GM-CSF膜修饰的MB49膀胱癌干细胞疫苗能增强特异性T淋巴细胞的杀伤肿瘤细胞的能力,从而有效地激活机体产生肿瘤特异性免疫反应。(4)运用SA-GM-CSF膜修饰的MB49膀胱癌干细胞疫苗可促进树突状细胞的成熟,有助于肿瘤抗原的递呈,从而可有效地激活机体产生针对肿瘤抗原的特异性免疫反应。(5)运用SA-GM-CSF膜修饰的MB49膀胱癌干细胞疫苗显著增加浸润在肿瘤组织中效应性CD4+、CD8+T淋巴细胞量,从而有效地直接杀伤肿瘤干细胞。(6)运用SA-GM-CSF膜修饰的MB49膀胱癌干细胞疫苗可诱导机体产生长期的保护性免疫反应,有助于小鼠抵抗MB49膀胱癌干细胞的再次攻击。(7)运用SA-GM-CSF膜修饰的MB49膀胱癌干细胞疫苗有效地诱导机体产生对抗同种肿瘤细胞(MB49膀胱癌干细胞)的特异性记忆性抗肿瘤免疫反应,能保护小鼠抵抗肿瘤的再次攻击。