目的急性肺损伤的发病率为78.9/10万人年,医院内死亡率较高。随着手术和麻醉技术的提高,越来越多的急性肺损伤患者在麻醉状态下接受手术,而且在重症监护室中急性肺损伤的患者经常使用到各种麻醉药物。麻醉药物的使用一方面可以抑制手术和疼痛应激反应,另一方面由于各种麻醉药物作用机制的不同,对免疫系统功能直接或间接地产生不同的影响。而在需要麻醉和重症监护的病人中有免疫抑制的患者比例在不断增加;免疫功能失常会引起术后和重症监护病人长时间的感染和败血症,重者可发生感染性休克和多器官功能衰竭,甚至死亡。因此,麻醉药物对机体免疫功能的影响已倍受关注。引起急性肺损伤和急性呼吸窘迫综合征（ARDS）的肺脏炎症是导致人类死亡的主要疾病之一。急性肺损伤主要表现为中性粒细胞大量内流入肺脏,促炎性介质的生成及肺上皮损伤。宿主受体识别脂多糖（LPS）是激发肺内多种细胞信号传导瀑布的最重要的第一步。LPS能刺激多种细胞使其激活,与靶细胞表面的CD14受体相结合。Toll受体4（TLR4）是LPS/CD14复合体的近端跨膜受体,作用于CD14下游,传导LPS信号。病原微生物抗原和内源性抗原等被细胞表面的TLR4识别后,通过依赖MyD88或非依赖MyD88信号转导途径激活NF-κB,进而诱导TNF-α、IL-1β、环氧合酶2、ICAM-1等多种细胞因子和化学因子的生成与释放,引发以中性粒细胞浸润、微血管内皮细胞损伤与蛋白液体渗漏为特征的炎症反应,TLR4和CD14被证实是脂多糖激活内在免疫信号转导途径进而激活NF-κB所必需的,而后者的活化是炎症反应的共同途径。CD14和TLR4在激活内在免疫系统、细菌吞噬作用和清除凋亡细胞等各种免疫反应中起重要作用。有研究显示LPS介导的宿主反应完全依赖于TLR4,仅部分依赖于CD14。另有研究显示吸入内毒素引起的支气管收缩和急性肺炎症完全依赖于TLR4/CD14/MD2复合体的表达。迄今,对于LPS介导的肺损伤机制尚未完全清楚。临床常用的静脉麻醉药包括非阿片类静脉麻醉药（丙泊酚、咪达唑仑等）和阿片类静脉麻醉药（雷米芬太尼、芬太尼等）。丙泊酚作为常用的非阿片类静脉麻醉药物,通过强化GABA-A受体发挥麻醉作用。咪达唑仑是苯二氮卓类镇静剂,作用迅速,半衰期短,对心脏呼吸影响小,也广泛应用于麻醉和重症监护室病人。雷米芬太尼是超短效阿片类受体激动剂,起效快,消除迅速,越来越多地用于临床麻醉。既往关于静脉麻醉药对急性肺损伤免疫机制的研究都局限于NF-κB下游细胞因子的研究。唯一关于丙泊酚对TLR4和CD14的研究仅在大鼠肝细胞系有报道:100μM丙泊酚预处理24小时能明显抑制TLR4,CD14,TNF-α等基因的表达。提示其可能减轻败血症相关性肝脏炎性反应。而关于丙泊酚对于肺组织NF-κB上游基因CD14和TLR-4的基因水平及蛋白表达的影响尚未有报道。其他麻醉药如咪达唑仑,雷米芬太尼等对急性肺损伤的作用研究很少。合理使用麻醉药物,减少手术和麻醉应激,尽量维持机体免疫系统的正常功能是非常重要的。本研究旨在进一步在在体水平及细胞水平探讨LPS诱导的急性肺损伤炎性反应通路以及不同种静脉麻醉药物对炎性反应通路的影响机制,找出能更好的保护肺脏的麻醉药物,降低机体的免疫反应,并为开发更好的抑制炎症反应的麻醉药物提供理论上的支持。实验材料1.实验动物:雄性Wistar大鼠,体重250-350克（在体实验）;SPF级雄性Wistar大鼠,体重180-250克（离体实验）。由中国医科大学实验动物部提供。2.主要实验试剂:LPS,丙泊酚,咪达唑仑,雷米芬太尼,Takara反转录试剂盒,兔抗大鼠CD-14一抗,羊抗大鼠TLR4一抗,小鼠抗大鼠β-actin一抗,羊抗兔二抗,兔抗羊二抗,TNF-αELISA试剂盒,SYBR PrimeScriptTM实时定量PCR试剂盒。3.主要实验仪器:呼吸机,微量输液泵,电泳凝胶成像分析系统,电泳仪,半干转印仪,酶标仪,分光光度计,荧光显微镜带自动照像和数字成像装置,ABI 7500型Real-TimePCR仪。实验方法1.脂多糖气管内注入制造急性肺损伤模型戊巴比妥钠50 mg/kg腹腔注射麻醉。戊巴比妥钠和哌库溴铵通过左颈内静脉泵入,右颈动脉插管连接监护仪行持续动脉压监测。正中气管切开,插入气管插管（14号套管针）。连接呼吸机行压力控制通气。气管内注入LPS 5 mg/kg（1ml/kg）。2.在体实验动物分组Wistar大鼠40只,随机分为5组,每组8例。空白对照组:气管内注入生理盐水,静脉泵入生理盐水LPS组:气管内注入LPS,静脉泵入生理盐水;丙泊酚组:气管内注入LPS,静脉泵入丙泊酚咪达唑仑组:气管内注入LPS,静脉泵入咪达唑仑雷米芬太尼组:气管内注入LPS,静脉泵入雷米芬太尼分别于气管内给药前、给药1h、3h和5h记录MAP和HR、采动脉血行血气分析。实时定量PCR测定肺组织CD14和TLR4mRNA表达。Western-blot法测定肺组织CD14和TLR4蛋白表达。ELISA法测定BALF中TNF-α水平。3.大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞原代培养戊巴比妥和肝素腹腔内麻醉,无菌开胸,气管插管。用生理盐水行肺循环冲洗,经气管导管用生理盐水灌洗肺泡腔。蛋白酶消化30min,将肺去气道后放入其中剪成1-2mm³的小块。100目和500目滤网依次过滤。Percoll梯度离心,取离心管内轻重比重Percoll溶液中间的细胞层,再次离心后DMEM液重悬细胞培养皿中放于培养箱中孵育。4.细胞实验分组,每只大鼠分离的ATII细胞随机分于五组:C组:对照组,不添加任何药物,培养3小时;LPS组:1μg.ml^-1LPS培养3小时;P1组:1μg.ml^-1LPS和25μM丙泊酚培养:3小时;P2组:1μg.ml^-1LPS和50μM丙泊酚培养3小时;P3组:1μg.ml^-1LPS和100μM丙泊酚培养3小时。实时定量PCR测定CD14和TLR4mRNA表达。Western-blot肺组织CD14和TLR4蛋白表达。免疫荧光双标检测CD14和TLR4在ATII细胞上的表达。ELISA法测定上清液中TNF-α水平。5.统计学处理:采用SPSS 13.0统计软件行统计分析。计量资料以均数±标准差表示,组间比较采用单因素方差分析,post hoc Tukey检验比较各组间差异。P＜0.05为差异有统计学意义。实验结果1.急性肺损伤模型制作成功本研究采用气管内注入LPS 5mg/kg建立ALI模型,以PaO₂/FiO₂≤300mmHg作为ALI模型制备成功标准。LPS、丙泊酚、咪达唑仑和雷米芬太尼组3h和5hMAP与对照组比较均有降低。LPS、丙泊酚、咪达唑仑和雷米芬太尼组3h和5hMAP与0h比较有降低。LPS、丙泊酚、咪达唑仑和雷米芬太尼组1、3、5小时PaO₂低于0小时的PaO₂。LPS、丙泊酚、咪达唑仑和雷米芬太尼组1、3、5小时PaCO₂,高于0小时的PaCO₂。HE染色可见明显肺泡壁水肿、出血和增厚以及炎性细胞浸润,动脉血气分析结果及病理学结果证明模型制备成功。2.在体动物实验LPS、丙泊酚、咪达唑仑和雷米芬太尼组CD14 mRNA表达与对照组比较均有增加。丙泊酚组CD14 mRNA表达明显低于LPS组和雷米芬太尼组。LPS组和雷米芬太尼组TLR4 mRNA表达明显高于对照组。丙泊酚组TLR4 mRNA表达明显低于LPS组。丙泊酚组和咪达唑仑组TLR4 mRNA表达明显低于雷米芬太尼组。LPS、丙泊酚、咪达唑仑、雷米芬太尼组CD14蛋白表达明显高于对照组。LPS、丙泊酚、咪达唑仑、雷米芬太尼组各组间CD14表达无显著差异。LPS、咪达唑仑、雷米芬太尼组TLR4蛋白表达明显高于对照组,丙泊酚组TLR4表达明显低于LPS组。丙泊酚、咪达唑仑组TLR4表达明显低于雷米芬太尼组。光镜下肺组织HE切片丙泊酚组及咪达唑仑组损伤较轻,雷米芬太尼组损伤较重。与对照组比较,LPS、咪达唑仑和雷米芬太尼组BALF中TNF-α明显增加,与LPS组比较,丙泊酚组BALF中TNF-α明显降低,雷米芬太尼组BALF中TNF-α明显增高。丙泊酚组和咪达唑仑组BALF中TNF-α明显低于雷米芬太尼组。CD14蛋白、CD14 mRNA、TLR4蛋白和TLR4 mRNA表达与TNF-α水平Pearson相关系数分别为0.515（P＜0.05）,0.672（P＜0.05）,0.543（P＜0.05）和0.787（P＜0.05）。3.原代培养ATII细胞AKP染色蓝染细胞为ATII细胞。透射电镜显示了ATII细胞的标准板层小体。ATII细胞纯度为85±5%。经Trypan蓝染色证实各组细胞活性为90-95%。4.细胞实验结果1μg/ml的LPS可以明显增加ATII细胞CD14mRNA和TLR4 mRNA表达。丙泊酚可以剂量依赖性的抑制LPS引起的ATII细胞的CD14mRNA和TLR4 mRNA表达。1μg/ml的LPS明显增加CD14蛋白和TLR4蛋白表达。丙泊酚剂量依赖性降低CD14蛋白和TLR4蛋白表达,并减少TNF-α产生。CD14和TLR4免疫双标检测证实二者在ATII细胞表面表达部位一致。CD14蛋白表达、CD14mRNA表达、TLR4蛋白表达和TLR4mRNA表达与TNF-α水平Pearson相关系数分别为0.639（P＜0.05）,0.643（P＜0.05）,0.774（P＜0.05）和0.634（P＜0.05）。结论1.LPS导致急性肺损伤大鼠在体肺组织及离体ATII细胞CD14和TLR4基因和蛋白水平的表达,增加TNF-α产生。2.丙泊酚下调在体大鼠肺组织及离体ATII细胞由LPS诱导的CD14和TLR4基因和蛋白的表达,并减少其TNF-α产生。3.丙泊酚和咪达唑仑与雷米芬太尼相比,能改善肺损伤。4.CD14和TLR4在ATII细胞表达部位一致,