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背景:慢性粒细胞白血病(chronic myeloid leukemia,CML)是一类由造血干细胞异常增殖导致的血液肿瘤。CML发病率约占所有白血病的15%,其特征是患者存在由t(9;22)(q34;q11)易位所产生的特异性Ph染色体,染色体异位后形成新的bcr-abl融合基因,该基因编码生成的融合蛋白P210具有强烈的酪氨酸激酶活性,能通过激活癌基因进而影响细胞的增殖、分化、凋亡和阻抑正常造血等多种重要功能。酪氨酸激酶抑制剂(tyrosine kinase inhibitor,TKI)在CML治疗方面显示出卓越的疗效,可诱导CML患者达到深层次且持续的疾病缓解状态。但目前仍约有10%的CML患者对TKI显示无疗效反应,对这类患者,异基因造血干细胞移植(allogeneic hematopoietic stem cell transplantation,allo-HSCT)是他们有望获得根治的唯一治疗选择。然而有临床研究表明,部分CML患者接受allo-HSCT术后会出现白血病复发进而导致治疗失败,严重影响其疗效。究其原因,主要是正常的造血干细胞在植入CML患者骨髓后,骨髓微环境对其归巢、黏附、定植的能力不足从而能导致移植治疗失败,目前,导致CML患者骨髓微环境中黏附功能缺陷的机制仍不清楚。外泌体是一类介导细胞间信息交流功能的细胞外囊泡,直径分布为30-150nm,几乎存在于所有体液中。外泌体具有携带母体细胞来源的蛋白质、mRNA、microRNA(miRNA)、细胞因子等多种生物活性物质,传递到受体细胞中发挥生物学作用的功能。我们前期通过基因芯片筛选来自CML细胞株K562细胞来源的外泌体和K562细胞内的具有差异表达的miRNA,分析发现相比于K562细胞,hsa-miR-711在K562细胞来源的外泌体中上调表达的幅度最高。且通过后续的生物信息学分析,进一步发现miR-711在黏附相关分子CD44 mRNA 3’-非翻译区(3’-UTR)序列上有结合位点,提示通过外泌体传递的miR-711可能与细胞内的黏附分子CD44结合进而调控其黏附功能。CD44是一类属于黏附分子家族的跨膜糖蛋白,具备激活体内淋巴细胞、介导细胞间的多种信号传导以及促进细胞黏附等多种生物学功能,CD44分子的异常表达也与许多肿瘤的侵袭和转移有着密切联系。综上所述,本研究主要探讨CML外泌体通过递送miR-711靶向抑制黏附分子CD44的表达从而调控骨髓微环境黏附功能的机制,为异基因造血干细胞移植失败的相关研究提供新的思路。目的:探讨CML细胞株K562来源的外泌体携带miR-711通过靶向结合黏附分子CD44,调节人骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BM-MSCs)的黏附功能,抑制其对造血干细胞的黏附作用,为更加深入理解CML异基因造血干细胞移植失败的机制及提高CML疗效提供新的思路。方法:利用超速离心法分离出K562细胞外泌体;采用透射电子显微镜和纳米粒度仪分别观察外泌体的形态和检测外泌体的粒径分布,蛋白免疫印迹法(Western Blot)用于检测K562细胞外泌体表面标志蛋白Alix和CD63的表达;通过荧光共聚焦显微镜监测BM-MSCs与外泌体共培养不同时间后,BM-MSCs摄取外泌体的动态变化;实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测K562细胞和外泌体内miR-711的含量;将BM-MSCs和K562细胞外泌体共培养24h后,未加外泌体处理的BM-MSCs设置为对照组,利用qRT-PCR检测实验组和对照组的BM-MSCs细胞内miR-711的表达差异;利用双荧光素酶报告实验验证miR-711与CD44的靶向作用;运用qRT-PCR和Western Blot检测miR-711拟似物和抑制物转染BM-MSCs后miR-711和CD44表达水平的变化。结果:(1)利用超速离心法成功提取出了K562细胞外泌体,经透射电子显微镜观察发现镜下的外泌体呈典型的的茶托样,外泌体粒径分布集中在100nm左右,且Western Blot结果显示外泌体有标志蛋白Alix和CD63的富集;(2)BM-MSCs细胞与外泌体共培养时间的不同,摄取外泌体的情况也有所不同,在共培养3h后外泌体即进入BM-MSCs细胞,在共培养9h后BM-MSCs细胞摄取外泌体的数量达到高峰,此后BM-MSCs细胞内外泌体的数量随着时间延长而减少;(3)K562细胞外泌体中miR-711的表达量明显高于K562细胞(P<0.001),且与外泌体共培养24h后的BM-MSCs内miR-711表达量明显高于对照组(P<0.05);(4)荧光素酶实验结果证明CD44是miR-711作用的靶标基因;(5)qRT-PCR和Western Blot结果显示,与对照组相比,经转染miR-711拟似物后的BM-MSCs内miR-711的表达水平升高而CD44的表达水平则出现下调;相反,转染miR-711抑制物后的BM-MSCs内miR-711的表达水平降低而CD44的表达水平则呈现上调现象。结论:本研究揭示K562细胞外泌体通过递送miR-711进入BM-MSCs,并下调细胞内黏附分子CD44的表达,进而削弱其对造血干细胞的黏附能力。为CML的造血干细胞移植失败的基础机制研究及临床治疗提供新思路。