免疫应答是一个非常复杂而又受到严格调控的过程,其分为固有免疫应答和获得性免疫应答。机体一方面可以通过激活免疫应答及时清除受感染或损伤的细胞,另一方面,机体也可以通过一些负向调控机制适时、适度地控制免疫应答,防止免疫应答过度激活,维持机体自身的免疫耐受和稳态。DC和NK细胞作为免疫应答中重要的免疫细胞,对激活免疫应答和维持免疫耐受起到了关键的作用。在机体受到病原体感染、炎症反应或者肿瘤发生过程中,就会释放一些胞外核苷酸,这些胞外核苷酸一方面可以作为危险信号,诱导免疫细胞迁移到炎症位点,另一方面,也可以作用于免疫细胞上的嘌呤受体发挥固有免疫应答和获得性免疫应答作用。通过查阅数据库发现嘌呤受体P2Y6在DC和NK细胞上高表达,并且在DC和NK细胞活化后,P2Y6受体的表达明显降低,这些结果提示我们P2Y6受体对DC和NK细胞可能具有重要的调控作用,因此本研究分别从DC和NK细胞的角度出发,探究P2Y6受体在固有免疫应答中的作用,为一些自身免疫性疾病和肿瘤的治疗提供新的理论依据和潜在的治疗点。第一部分 嘌呤受体P2Y6对DC发育和功能的影响及其机制的研究树突状细胞(Dendriticcells,DCs)在免疫系统中作为专职的抗原递呈细胞(Antigen presenting cells,APCs),具有极强的抗原吞噬能力,在摄取抗原(包括体外加工)或受到某些因素刺激时即分化为成熟DC。成熟的DC表现为吞噬功能降低,表达高水平的共刺激因子如CD80/CD86和MHCⅡ分子,抗原递呈能力增强,能有效激活初始型T和B细胞。DC处于启动、调控、并维持免疫应答的中心环节。DC的过度活化可导致T细胞、B细胞直至整个免疫应答的功能紊乱。在激活免疫应答和维持免疫耐受中发挥着关键的作用,也在连接固有免疫应答和获得性免疫应答中起到桥梁作用。但是有关控制DC的成熟以及DC诱导T细胞分化的机制仍然不是很明确。DC表面表达多种模式识别受体如Toll样受体(TLRs)等,可以识别外来病原微生物及其特定的组分,启动免疫应答。大量的临床资料证明,DC的过度活化在多发性硬化症(Multiple sclerosis,MS)和系统性红斑狼疮(Systemic lupus erythematosus,SLE)等多种自身免疫性疾病发生发展中起重要的作用。因此,寻找负向调控TLRs引起的DC过度激活机制对于进一步探索免疫识别和免疫应答的调控机制具有重要的理论意义,也对一些自身免疫性疾病的治疗提供新的治疗思路和潜在靶点。G蛋白偶联受体(GPCR),又叫七次跨膜受体,是细胞表面膜受体中最大的多样性家族,人类基因组中大约4%的编码蛋白的基因为GPCR家族。GPCR在将细胞外信号传入细胞内中起重要的作用。GPCR在体内的数量极多,在多种系统中发挥重要的生理作用,因此被作为多种疾病的治疗靶点,比如心血管系统、神经系统、免疫系统、代谢和内分泌系统等方面的疾病。同时,GPCR在癌症的发生中也起着重要的作用。P2Y6受体是一种胞外核苷酸受体,定位于11号染色体上,编码328个氨基酸残基,属于G蛋白偶联受体家族,其内源性配体是UDP,许多研究已经证明P2Y6受体在固有免疫应答中起重要的作用。最近的研究发现,P2Y6受体在体内能够抵抗细菌感染和病毒感染;P2Y6受体的激活能够引起树突状细胞、嗜酸性粒细胞和内皮细胞释放一些趋化因子,这些趋化因子能够招募炎性细胞迁移到炎症部位或者感染部位。同样有研究表明,神经元损伤能够释放UTP和UDP,引起小胶质细胞上P2Y6受体的表达量升高,并且UDP能够促进小胶质细胞吞噬死亡细胞的能力。我们前期的研究发现激活的DC中P2Y6表达水平下调,提示P2Y6可能对调节DC的功能具有一定的作用,为了明确其对DC的免疫调节作用及其机制,我们从细胞、分子和动物水平对P2Y6受体对DC的发育和功能调控进行了系统地研究。1.P2Y6受体显著抑制DC的成熟与激活首先我们利用RNAseq的方法检测DC在活化状态后P2Y6的表达情况,实验结果表明,DC在LPS刺激后,P2Y6受体的表达量显著降低。同时我们也用RT-qPCR进行验证,得到同样的结果。为了进一步探究P2Y6受体在蛋白水平上是否也存在同样的变化。我们检测了在LPS和Poly(I:C)刺激后,P2Y6受体蛋白水平上的变化,流式结果显示,P2Y6受体在蛋白水平上的表达仍然显著下调。随后我们观察了 WT和P2Y6受体敲除小鼠脾脏DC的成熟情况,实验结果发现,当DC在LPS刺激后,与野生型小鼠相比,P2Y6受体敲除小鼠脾脏DC表面分子CD40和CD86的表达水平明显上调,但MHCⅡ的表达水平没有明显差异。为了更进一步的确定P2Y6受体抑制DC的成熟和激活,我们对小鼠骨髓来源的DC表型进行分析。实验结果发现P2Y6-/-DC表面分子CD40和CD86的表达水平与野生型相比均有很明显的升高。同时我们也用了 P2Y6受体的配体UDP进行验证,结果发现UDP能够显著抑制DC表面分子CD40和CD86的表达,而对MHC Ⅱ的表达水平没有明显影响。2.P2Y6受体显著抑制DC的抗原递呈反应我们首先观察了 WT和P2Y6-/-BMDC的吞噬功能,实验结果发现WT和P2Y6-/-DC对FITC标记的葡聚糖的吞噬能力没有显著的差异。我们进一步利用OTⅡCD4+T细胞的增殖实验观察了 DC抗原递呈能力,实验结果发现,P2Y6-/-的DC具有更强的抗原递功能。体外实验证明,P2Y6受体能够抑制DC的抗原递呈能力,我们进一步利用接触性超敏反应皮炎实验(CHS)分析DC的抗原递呈功能,实验结果发现注射P2Y6-/-DC的小鼠耳朵的厚度明显厚于注射WT DC小鼠的。HE染色结果也证明,注射P2Y6-/-DC的小鼠耳朵的厚度确实厚于注射WT DC小鼠的。以上三个实验表明了 P2Y6受体不能够影响DC的吞噬能力,但是能够抑制DC的抗原递呈的能力。3.P2Y6受体能够改变DC分泌的细胞因子表达谱成熟后的DC能够分泌更多的细胞因子参与免疫应答反应。因此我们从RNA水平和蛋白水平分别对P2Y6受体是否影响DC中细胞因子的表达进行了研究。实验结果表明,在RNA水平和蛋白水平上P2Y6-/-DC能够产生更多的IL-12和IL-23。为了进一步验证这一结果,我们也用了 P2Y6受体的配体UDP进行实验,实验结果显示,UDP能够抑制DC中IL-12p35、IL-12p40和IL-23p19的表达。4.P2Y6受体抑制DC介导的Th1和Th17细胞的分化研究已经表明,DC分泌的细胞因子IL-12能够诱导naive CD4+ T细胞分化成Th1细胞,DC分泌的细胞因子IL-23能够诱导naiveCD4+T细胞分化成Th17细胞。因此我们设计了 DC培养上清与脾脏来源的naive CD4+ T细胞共培养实验。流式结果表明,P2Y6-/-的DC培养上清能够诱导naive CD4+ T细胞向Th1和Th17细胞分化。为了进一步验证这一结果,我们也利用了 P2Y6受体的配体UDP进行实验,实验结果显示,UDP处理过的DC细胞培养上清组与对照组相比,显著的抑制了 naive CD4+ T细胞向Th1和Th17细胞分化。5.P2Y6受体不直接影响小鼠体内T细胞的分化以上实验结果证明了 P2Y6受体能够影响DC的功能,进而影响了 T细胞亚群的分化。为了进一步探究P2Y6受体敲除后是否能够直接影响T细胞的发育和分化。我们首先检测了 P2Y6受体敲除后小鼠体内T细胞的比例变化。实验结果显示,P2Y6受体敲除之后,不能够影响CD3、CD4和CD8+T细胞的比例。随后我们对小鼠体内T细胞亚群进行了分析,实验结果表明,P2Y6受体敲除以后,小鼠脾细胞中Th1、Th17和Treg细胞的比例没有明显的差异,这说明P2Y6受体并不影响小鼠体内T细胞亚群Th1、Th17和Treg细胞的分化。为了进一步验证P2Y6受体是否直接影响T细胞的分化,我们也设计了体外诱导T细胞亚群分化的实验。实验结果表明,细胞因子诱导的野生型和P2Y6受体敲除的CD4+ T细胞分化为Th1、Th17和Treg的比例没有明显的差异,说明了 P2Y6并不直接影响CD4+ T细胞的分化。6.P2Y6受体抑制LPS诱导的NF-KB的激活上述实验结果表明P2Y6受体能够抑制DC的成熟,抑制DC的抗原递呈功能,抑制DC分泌细胞因子IL-12和IL-23,从而抑制了 DC诱导T细胞向Th1和Th17细胞的分化。为了研究对P2Y6受体影响DC的这些功能的机制。我们检测了 TLR信号通路中相关蛋白的磷酸化情况。首先检测了在LPS刺激后,DC中Erk1/2、JNK和p38的磷酸化水平,实验结果显示P2Y6-/-DC中Erk1/2、JNK和p38的磷酸化水平与WTDC的磷酸化水平相比较没有明显的差异,说明P2Y6受体不是通过MAPK信号通路来影响DC功能的。随后我们检测了在LPS刺激后,DC中NF-KB信号通路相关蛋白磷酸化情况,实验结果显示,P2Y6-/-DC中的p65、IKKα/β、IKBα的磷酸化水平明显比WTDC中的高。以上实验数据均说明了 P2Y6受体敲除以后可以促进LPS诱导的NF-KB信号通路的激活,而并不影响MAPK信号通路中的JNK、Erk1/2和p38的磷酸化。7.P2Y6受体抑制自身免疫性疾病EAE的发生研究表明Th1和Th17细胞在自身免疫性疾病EAE的发展中发挥着重要的作用。为了证明小鼠体内P2Y6是否通过抑制DC→IL-12/IL-23→Th1/Th17细胞这一通路抑制自身免疫性疾病的发生,我们通过MOG(35-55)多肽和PTX联合免疫法建立EAE模型,观察了 P2Y6受体在EAE模型中的作用和功能,并且也分析了相关细胞和分子机制。实验结果显示,P2Y6受体敲除后,EAE小鼠临床评分更高,脊髓中炎性细胞的浸润更多,脱髓鞘程度更加严重,并且CNS中Th1和Th17细胞的比例以及脾脏中DC分泌的IL-12和IL-23更高。以上结果表明,P2Y6受体能够通过抑制DC分泌的IL-12和IL-23,从而抑制了 CD4+ T细胞向Th1和Th17细胞的分化,进而抑制了 EAE的发生。综上,本实验得出以下结论:首先DC在成熟和激活后P2Y6受体的表达下调;其次P2Y6受体通过能够抑制LPS诱导的NF-KB信号通路的激活抑制了 DC的成熟、DC的抗原递呈和IL-12和IL-23产生;最后P2Y6受体能够通过抑制DC的功能抑制了自身免疫性疾病EAE的发生。第二部分嘌呤受体P2Y6对NK细胞成熟和功能的影响及其机制的研究天然免疫应答对于机体抵抗病原体的感染和肿瘤的发生发挥重要的作用。NK细胞是连接固有免疫和获得性免疫的一种重要的免疫细胞,它能够通过分泌一些细胞因子和杀伤性介质来杀伤肿瘤细胞和病毒感染的细胞,在介导免疫应答和免疫耐受中起到一个关键的作用。NK细胞的发育和激活受到免疫系统的精细调控,但是对于其调控机制并不是很明确。NK细胞的发育极其复杂,它起源于CLP,经历了 NKp细胞阶段、iNK细胞阶段和mNK细胞阶段。成熟的NK细胞和过度活化的NK细胞的细胞因子和杀伤性介质的分泌增多,杀伤功能增强。如果NK细胞过度活化就会导致一些自身免疫性疾病的发生如多发性硬化症(MS)和系统性红斑狼疮(SLE)等。尽管关于NK细胞如何被激活以及如何清除受感染的细胞和肿瘤细胞的研究很多,但是对于NK细胞激活的负调控的详细机制仍不清楚。因此,探索负向调控NK细胞的发育和活化对于进一步探索免疫耐受和免疫应答的调控机制提供了很重要的理论依据,并且对为NK细胞过度活化引起的身免疫性疾病和肿瘤的治疗提供潜在的靶点。P2Y6受体是胞外核苷酸受体家族中的一员,属于GPCR。关于GPCR如何调控NK细胞的功能的研究非常少,最近研究发现GPR56(ADGRG1)是NK细胞的一个抑制性受体以及ATP能够通过激活P2Y11受体抑制NK细胞的迁移和杀伤作用。在此基础上本实验从NK细胞的发育、成熟、激活以及细胞因子产生与机制的角度,对P2Y6受体如何负向调控NK细胞的活化及其功能进行以下的研究。1.P2Y6受体显著抑制NK细胞的成熟本实验我们首先分析了 NK细胞活化后P2Y6受体的表达情况,体内和体外实验结果显示,脾脏NK细胞在Poly(I:C)刺激后,P2Y6受体的表达明显的下调。为了探究是否其他活化NK细胞的刺激剂也能够影响P2Y6受体的表达,我们利用IL-15刺激小鼠脾脏细胞,实验结果发现,IL-15活化NK细胞后的P2Y6受体在RNA水平和蛋白水平上的表达与对照组相比也是明显降低。同时本实验也利用了人的NK细胞系NK-92进行了研究,分别用Poly(I:C)、IL-15、IL-2刺激NK-92细胞,荧光定量PCR结果发现,NK细胞活化后P2Y6受体的表达均下调。另外,我们也分离出人的外周血NK细胞,用IL-15刺激后,结果发现P2Y6受体的表达同样下调。为了研究P2Y6受体敲除后对小鼠免疫系统是否有影响,我们分析了 P2Y6受体敲除小鼠体内的免疫细胞的比例变化。实验结果发现,P2Y6受体敲除小鼠脾脏中的T细胞、B细胞和单核细胞没有明显的变化。同样我们也检测了 P2Y6受体敲除小鼠骨髓、淋巴结、肝脏和肺中NK细胞的比例,结果显示也没有很明显的变化。由于P2Y6受体不能够影响小鼠体内总的NK细胞比例的变化,因此我们对P2Y6受体是否影响NK细胞的发育进行了研究。实验结果显示,与WT小鼠相比较,P2Y6敲除后脾脏NKp细胞的比例降低,iNK细胞的比例明显增多,这些结果表明P2Y6受体能够抑制NKp细胞向iNK细胞的发育。为了进一步研究P2Y6受体是否影响NK细胞的成熟,我们对WT和P2Y6受体敲除小鼠的骨髓、淋巴结、脾脏、肝脏和肺中NK细胞的亚群进行分析,实验结果发现,P2Y6受体敲除小鼠的骨髓和淋巴结中CD11b-CD27+NK细胞、CD11b+CD27+NK细胞和CD 1 1b+ CD27-NK细胞的比例与WT小鼠的相比较没有明显的差异,但是P2Y6受体敲除小鼠的脾脏、肝脏和肺中CD11b+CD27-NK细胞的比例显著高于与WT小鼠。2.P2Y6受体抑制NK细胞的效应功能我们首先分析了在静息状态下NK细胞的细胞因子和杀伤性介质的分泌以及抑制性受体和激活性受体的表达情况。实验结果发现,P2Y6受体敲除后,脾脏中NK细胞分泌的IFN-γ和Gzm B与WT小鼠相比较没有明显变化。同时我们也检测了 NK细胞表面的激活性受体(NKG2D)和抑制性受体(NKG2A和KLRG1)的表达,也得出同样的结果。这些实验结果说明,在静息状态下,P2Y6受体不影响小鼠脾脏中NK细胞的效应功能。为了进一步探究活化后NK细胞中IFN-γ的分泌,我们利用Poly(I:C)、IL-15、IL-12和IL-15联合以及PMA刺激小鼠脾脏细胞,实验结果发现,与WT小鼠相比较,P2Y6受体敲除后在Poly(I:C)、IL-15、IL-12和IL-15联合以及PMA刺激后NK细胞均能够分泌更多的IFN-γ。同时我们也利用P2Y6受体的激动剂UDP或UDP的类似物5-OMe-UDP处理小鼠脾脏细胞、NK-92细胞株或人外周血NK细胞,实验结果显示,UDP或5-OMe-UDP都能抑制NK细胞中IFN-γ的产生。为了进一步探究P2Y6受体是否影响NK细胞的效应功能,我们设计了体外杀伤实验和体内肿瘤转移模型实验。体外实验结果发现,P2Y6-/-NK细胞杀伤效果高于WTNK细胞的。体内肿瘤转移模型实验发现,注射P2Y6-/-NK细胞的小鼠肺部的结节以及肺的重量均明显的低于注射WTNK细胞的小鼠。3.P2Y6受体通过抑制NK细胞中T-bet的表达抑制NK细胞的成熟与功能为了进一步阐明P2Y6受体影响NK细胞成熟的机制,我们对WT和P2Y6受体敲除小鼠脾脏中NK细胞及其亚群中转录因子T-bet和Eomes进行检测。实验结果发现,P2Y6-/-NK细胞中T-bet的表达明显高于WTNK细胞,然而Eomes的表达没有明显的变化。同样对脾脏NK细胞亚群中T-bet进行检测发现,P2Y6受体敲除小鼠脾脏 CD 11b-CD27+ NK细胞、CD 11b+ CD27+NK 细胞和 CD 11b+ CD27-NK细胞中T-bet的表达均明显高于野生型,然而Eomes表达与野生型相比没有明显的差异。同时我们发现小鼠脾脏NK细胞在IL-15刺激后,P2Y6-/-NK细胞T-bet的表达明显的高于WTNK细胞。为了进一步验证此结果,我们也利用了P2Y6受体的激动剂UDP或5-OMe-UDP刺激小鼠NK细胞、人NK细胞系NK-92或人外周血来源的NK细胞,实验结果显示,UDP或5-OMe-UDP刺激组T-bet的表达明显的低于对照组。4.P2Y6受体通过抑制mTOR信号通路的激活调节IL-15刺激引起的NK细胞的活化为了研究P2Y6受体通过什么机制来调节NK细胞中T-bet的表达进而影响了 NK细胞的成熟与激活。我们首先对IL-15下游的信号通路进行检测。实验结果显示,WT和P2Y6-/-NK细胞中,p-Foxo1的水平并没有明显的差异,并且总的NK细胞和不同成熟时期的NK细胞中的Foxo1的表达也没有明显的差异。我们也检测了 WT和P2Y6受体敲除NK细胞上IL-15受体CD122和CD132的表达,实验结果显示两者均没有明显的变化。接着,我们检测了 IL-15刺激后NK细胞中与mTOR信号通路相关的CD71和CD98分子的表达,结果显示P2Y6-/-NK细胞中CD71和CD98的表达明显高于WTNK细胞,同时我们检测到P2Y6-/-NK细胞中Akt、S6蛋白的磷酸化水平明显的高于WTNK细胞,而4EBP1磷酸化水平没有明显的区别。综上,本实验得出以下结论:首先,NK细胞在活化后能够下调P2Y6受体的表达;其次,P2Y6受体能够通过抑制T-bet的表达抑制NK细胞的成熟与活化;最后,P2Y6受体能够通过抑制NK细胞中p-Akt和pS6的水平抑制NK细胞T-bet的表达,从而抑制了 NK细胞的成熟与活化,进而抑制了 NK细胞杀伤肿瘤的功能。本研究证明了 P2Y6受体负调控NK细胞的成熟与激活,并阐明了其分子机制,为与NK细胞相关的疾病治疗提供了潜在的靶点。