嗅觉受体（Olfactory receptors,ORs）在气味分子识别过程中处于核心地位,其功能研究备受关注。因昆虫嗅觉感器中存在大量且变异程度高的嗅觉受体,长期以来昆虫嗅觉受体的“脱孤”技术一直备受瞩目。然而,因嗅觉受体是结构复杂的膜受体蛋白,建立简便、快速、可靠的昆虫嗅觉受体功能离体检测方法仍是该领域的巨大挑战。即使已经进入后基因组时代,受嗅觉受体“脱孤”技术的限制,昆虫嗅觉受体的配体鉴定工作仍然进展缓慢。目前,昆虫嗅觉受体的离体表达系统有3种,包括爪蟾卵母细胞、哺乳动物细胞和昆虫细胞。其中爪蟾卵母细胞表达系统结合双电极电压钳记录技术是离体测定嗅觉受体气味结合能力的黄金标准,然而该技术体系极其依赖爪蟾卵母细胞质量、操作复杂、耗时长、难以实现高通量测定。相比之下,基于HEK293细胞系的钙离子成像技术,具有操作简便、耗时短、通量高等特点,有望用于昆虫嗅觉受体气味结合能力的高通量筛选。因此,本研究围绕桔小实蝇嗅觉受体的离体活性测定,通过两种技术体系的比较,为建立简便高效的昆虫嗅觉受体“脱孤”技术提供重要参考。主要研究结果如下:1.桔小实蝇嗅觉受体异源表达载体构建根据实验室已掌握的桔小实蝇高质量基因组和转录组数据,本课题组已注释了73个OR-like基因。设计引物后,经巢式PCR扩增,本研究获得了38个嗅觉受体（包括桔小实蝇嗅觉受体协同受体,ORco）的ORF全长;经酶切、连接及菌液检测,将38个OR-like基因成功克隆到爪蟾卵母细胞表达载体p T7Ts上。2.基于爪蟾卵母细胞表达系统的桔小实蝇嗅觉受体离体活性测定利用基于非洲爪蟾卵母细胞表达系统的双电极电压钳记录技术,我们测定了38个桔小实蝇嗅觉受体与22种气味物质的离体结合能力,发现10个嗅觉受体可结合其中12种气味物质。其中8个受体（Bdor OR4、Bdor OR6、Bdor OR10、Bdor OR11、Bdor OR18、Bdor OR36、Bdor OR43a-1、Bdor OR47）对1-辛烯-3-醇、苯并噻唑、柠檬醛等气味物质的结合能力呈明显的剂量依赖性。此外,有两个受体（Bdor OR5、Bdor OR63a-1）疑似可结合100μM浓度下的正己醇、丁酸乙酯、马来酸二乙酯等气味物质。3.基于HEK293细胞瞬时表达系统的桔小实蝇嗅觉受体离体活性测定利用基于HEK293细胞瞬时表达系统的钙离子成像技术对上述结果进行验证,总体结果相似。在此过程中,我们使用了两种哺乳动物细胞表达载体:一种是共转染的pcDNA3.1（+）载体,并重新融合了荧光蛋白标签,提高了可观察性;另一种是含双向启动子盒的p CMV-BI载体,可同时驱动两个基因的表达,结果显示8个嗅觉受体中仅有4个受体（Bdor OR11、Bdor OR18、Bdor OR36、Bdor OR47）对相应气味物质有剂量依赖性反应。为了提高嗅觉受体异源表达效率,我们选择了2个受体（Bdor OR11、Bdor OR36）基因构建最小N末端肽标签,将其合成并亚克隆到p CMV-BI载体中,结果显示Ca2+反应未显著增加。