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植物寄生线虫(plant-parasitic nematodes,PPNs)是一类严重威胁现代农业的植物病原生物,宿主范围极广,多侵染植株地下根部,病原隐蔽性强。根结线虫(Meloidogyne spp.或root-knot nematodes,RKNs)是所有PPNs中危害最严重的种类,利用现有资源难以防治。苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)是潜在的线虫病原菌,蕴含多重杀线虫毒素。CT-43菌株是本实验室早期分离到的高毒力Bt菌株,虽然具有良好的田间生防效果,但人们对其活性组成仍不甚了解。本室前期在寻找CT-43菌株新型杀线虫毒素时,发现了一种高丰度且对南方根结线虫(M.incognita)表现良好毒杀活性的未知组分CT-A。化学结构鉴定结果显示,CT-A是已知物质反式乌头酸(trans-aconitic acid,TAA,174.11 Da)。TAA与细胞三羧酸(tricarboxylic acid,TCA)循环的中间代谢产物——顺式乌头酸(cis-aconitic acid,CAA)互为异构体,且是该循环中乌头酸酶(aconitase,ACO)的竞争性抑制剂。虽然人们早已发现自然界中植物和微生物会产生并积累这种不寻常的细胞代谢物,但其生物合成途径及生物学意义却一直未被揭示。本研究正是基于CT-A(TAA)杀线虫活性的新发现,对上述科学问题依次开展了研究,主要研究内容与获得成果如下:1)明确了TAA(CT-A)杀线虫活性与特征首先,通过南方根结线虫体外生物测定,发现了CT-A高纯品与TAA商业标准品具有极为相近的毒杀特性和半致死浓度,从活性水平上证明了CT-A是TAA;接着,发现了TAA相较CAA具有更强劲的杀线虫活性,且该活性为反式构象所赋予;其次,还发现了TAA具有抑制南方根结线虫虫卵孵化的活性。2)首次克隆了TAA(CT-A)生物合成基因簇,阐释了TAA合成途径克隆CT-43菌株中CT-A毒素合成基因簇的相关工作在其结构鉴定之前便已开展。已知pCT281质粒与该毒素合成密切相关。本研究首先针对pCT281质粒(281,231bp)全序列设计了26个独立敲除实验,涉及57个靶标基因。最终,研究获得了7个敲除突变株,涉及13个候选基因,但HPLC分析表明它们均与CT-A合成无关。在上述敲除实验仍在进行时,CT-A结构被解析,这使得克隆目标变得明确。已知异构酶是微生物合成TAA的关键酶。于是,研究利用CD-Search在pCT281质粒上搜寻到了唯一一个编码蛋白质与已报道的假定异构酶同源的基因CT43_RS29745(1,074 bp),命名为TAA biosynthesis-related gene A(tbrA),同时将其下游111 bp处的假定膜蛋白编码基因CT43_RS29750(912 bp)命名为tbrB。通过对tbr基因进行异源表达、同框缺失和回补等遗传操作以及基于RT-PCR的转录分析实验,证实了tbrA与tbrB组成的tbr操纵子是CT-43菌株中TAA生物合成基因簇。随后,本研究通过体外催化实验证明了TbrA具有乌头酸异构酶的催化活性;通过荧光显微镜观察和Western blot杂交,首先证明了TbrB的细胞膜亚定位,又通过分析tbr基因缺失以及增加tbrB膜蛋白基因拷贝数对细胞分泌TAA能力的影响,证明了Tbr B蛋白负责转运TAA的生物学功能。综上,本研究揭示了由tbr操纵子介导的毒素TAA的异构合成途径。此外,生物信息学分析表明,TAA合成操纵子还分布于其他蜡状芽胞杆菌群菌株中,这暗示小分子毒素TAA可能参与了较为广泛的芽胞杆菌与线虫之间的相互作用。3)揭示了植物内源TAA含量与植物防御线虫能力之间的正相关关系本室前期研究发现,植物源TAA也具有毒杀根结线虫的活性。本研究首先测定了不同植物根内TAA含量,并通过综述文献对各物种防御线虫的能力进行了分类,结果发现,根内TAA含量高的植物均为具有良好抵御线虫能力的宿主,而TAA含量低的物种均为易受线虫感染的宿主,这说明植物内源TAA含量正比于植物对线虫的抗性,也暗示了植物TAA含量是潜在的抗性育种生化标记。4)预测了潜在的植物(玉米)TAA合成相关基因序列比对分析表明,能合成TAA的植物基因组中不含有与微生物tbr基因同源的序列。为寻找植物TAA生物合成基因,本研究首先测定了一个玉米关联群体中455份叶片样本的TAA含量;随后通过与外室合作,以玉米B73基因组为参考基因组,通过全基因组关联分析(genome-wide association study,GWAS)提名了2个潜在的TAA合成相关基因,分别为位于2号染色体的假定蛋白编码基因(GRMZM5G874896)与位于3号染色体的生长素受体蛋白(auxin-binding protein 1 precursor,ERABP1)编码基因(GRMZM2G116204)。该预测结果还需进一步验证。5)证明了TAA活性资源在植物根结线虫防治中的应用潜力本研究将高含TAA的玉米叶片进行粉碎并拌土,发现该处理能显著抑制病变根结的产生且不影响植株正常生长;利用高产TAA重组芽胞杆菌发酵液灌根也能显著降低根结数量;此外,研究还发现TAA对同样危害巨大的孢囊线虫也具有良好毒杀活性。基于此,本研究提出了利用TAA资源防治植物寄生线虫的多元策略模型。