论文部分内容阅读
能引起鸡病的病原微生物很多,其中病毒是最主要的病原体。目前临床上常见的鸡病毒性疾病有禽流感、传染性喉气管炎、传染性支气管炎、鸡新城疫、鸡痘、鸡传染性法氏囊病、鸡传染性脑脊髓炎、鸡马立克病及鸡白血病等,已给养鸡业造成了巨大的损失。然而,在日常养鸡生产中,经常会出现不明原因的疾病感染,采用常规手段则难以实现快速及时地进行病原确定、疾病诊断与防治。以二代测序为基础的病毒宏基因组技术广泛应用于未知病原的检测,目前该技术已成功用于环境新病毒筛查、哺乳动物和鸟类肠道病毒类群分析以及人疾病与病原相关性的探究等。但针对鸡肠道病毒宏基因组的相关研究报道还较少。本研究将采集的安徽境内2个鸡场（分别为鸡白血病非净化鸡场和鸡白血病净化鸡场）粪便样品,通过建立病毒宏基因组文库,进行肠道病毒群落组成分析和新病毒的筛查,旨在明确不同鸡场的优势病毒类群及其潜在的流行感染性,筛选潜在引发鸡病的新病毒,从而为鸡病的流行病毒学、诊断与防制提供理论支撑。研究内容:（1）采集安徽境内的2个鸡场（鸡白血病非净化鸡场编号为A、鸡白血病净化鸡场编号为B）粪便样品,每个场30份,共计60份,利用文库构建试剂盒构建4个文库（ASt01、ASt02、BSt03、BSt04）,并对构建的文库进行纯化和检测;（2）将文库的原始序列进行数据处理,分析不同文库的病毒序列数及病毒类群差异;（3）对文库潜在致病的病毒序列进行同源性比对和遗传进化分析;（4）对筛选自文库的优势病毒进行鉴定和分析;（5）通过初步序列比对发掘潜在的重组病毒,应用重组分析软件RDP4.0进行基因重组分析并对不同重组区段分别构建系统进化树;（6）基于发掘的重组病毒全基因序列,设计套式PCR引物,对A场和B场共60份样品进行检测。结果显示:（1）构建的4个文库ASt01、ASt02、BSt03、BSt04符合Miseq测序平台的上机合格要求。（2）ASt01和ASt02病毒序列数分别为46,607条和45,497条,除去植物病毒序列及噬菌体病毒科序列等,冠状病毒科、未分类病毒科、小RNA病毒科的占比分别为49.82%和30.90%、25.20%和28.95%、20.79%和20.65%。BSt03和BSt04病毒序列数分别为15,951条和17,054条,除去植物病毒序列及噬菌体病毒科序列等,未分类病毒科、逆转录病毒科、圆环病毒科的占比分别为40.75%和57.87%、39.15%和13.20%、9.07%和10.78%。（3）A场发现星状病毒、杯状病毒、小双RNA病毒各1株,圆环病毒2株（Smaco1和Smaco2）。Ast V与源自韩国的KM254166毒株相似度为87.2%,且与源自巴西的禽肾炎病毒MG846415毒株、MN732559毒株等聚为一支。杯状病毒与JQ347532毒株相似度为86.8%,且与鸭源MN175552毒株聚为一支。小双RNA病毒与源自香港的KU729767毒株相似度为63.4%。Smaco1和Smaco2为环状病毒的不同属,Smaco1的Cap结构与源自越南的MH111124毒株相似度为59.6%,且聚为一支;Rep结构位于Porprismacovirus属的分支,与源自越南的MH500336毒株相似度为64.8%,但与源自越南的MH500333毒株聚为一支。Smaco2的Cap结构位于Bovismacovirus属的分支,与源自美国的KM598409毒株相似度为41.8%;Rep结构独立成一个分支,与源自越南的MH111124毒株相似度为62.7%。B场发现1株鸡白血病病毒（ALV）和1株小RNA病毒,其中ALV与源自中国的JF932002毒株相似度为96.3%。小RNA病毒与源自美国的鸡源LC123275毒株相似度为36.4%,但独立成为一个分支,可能为病毒新种。（4）从ASt01中获得全长为27718bp的禽支气管炎病毒全基因组序列,命名为ahysx-1,共编码10个开放阅读框,该全基因组的非S基因区段与鸡中发现的一株KX252787毒株（IBV）相似度为98%,S基因区段则与其相似度为58%,但与火鸡冠状病毒EU022526毒株相似度为79%,预示病毒存在潜在重组。（5）RDP4.0分析发现ahysx-1存在重组现象,重组概率p<6.2×10-15,重组位点为S基因区段,重组主要亲本为KX252787毒株,次要亲本为EU022526毒株。基于非S基因区构建的系统进化树,ahysx-1与5种鸡IBV的相似度均为98%;基于S基因区构建的系统进化树,ahysx-1与3种火鸡冠状病毒和1种珍珠鸡冠状病毒相似度为74.8%-75.9%;验证了重组结果。（6）检出的11份IBV阳性样品均来自A场,阳性率为36.7%。结果表明:鸡白血病非净化A场病毒序列总数为92,104条,以冠状病毒科为主;鸡白血病净化B场病毒序列总数为33,005条,以未分类病毒科为主;A场与B场的病毒类群组成及病毒丰富程度存在差异,A场的病毒序列数是B场的2.79倍,鸡白血病的净化有利于减少鸡场的病原分布、降低鸡体的病毒载量。A场筛查的一株潜在致病病毒（代号ahysx-1）系为重组鸡传染性支气管炎病毒（IBV）,重组体的S基因源于火鸡冠状病毒,非S基因来自于IBV。A场鸡群中存在IBV的感染,具有发生IB的高风险。