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疾病标志物,包括蛋白质、核酸和酶等物质,是特定时间疾病生理状态的“分子标志”,其在组织或血清中的异常表达往往与多种人类疾病密切相关。因此,设计一种简单、快速、准确的疾病标志物检测方法对疾病早期诊断和治疗是极其重要的。荧光法具有操作简单、方便省时、灵敏度高等优点,已被广泛用于生物分子的分析检测。基于荧光共振能量转移(Fluorescence resonance energy transfer,FRET)的荧光分析法因其背景干扰低、精度高等优势,也在分析检测及成像领域获得科学家的青睐。碳点(Carbon dots,CDs)作为一种新型的碳纳米材料,具有制备简单、水溶性好、光稳定性好和发光波长可调等优点,是FRET体系中理想的能量供体。通过对CDs表面进行修饰,并以CDs作为能量供体,建立一系列简单、快速、灵敏的FRET分析方法,对进一步拓展基于CDs的FRET策略在疾病标志物分析检测中的应用具有重要意义。为此,本文开展了以下三个研究内容:1.制备富含羧基官能团的CDs作为荧光共振能量供体。在CDs的制备过程中,原料分子的某些基团会保留在CDs表面,因此,我们选择了富含羧基的柠檬酸作为碳源,精胺作为氮源,通过简单的水热法制备表面富含羧基的CDs。X射线光电子能谱(X-ray photoelectron spectroscopy,XPS)、傅立叶变换红外光谱仪(Fourier transform infrared spectroscopy,FT-IR)等表征结果表明,所制备的CDs表面富含羧基官能团,并且该CDs具有优异的光稳定性、盐稳定性和抗氧化性。这些优良性质为后续CDs的表面修饰以及以CDs为能量供体用于疾病标志物的分析检测奠定了基础。2.以CDs为能量供体,并结合无酶催化发卡自组装(Catalyzed hairpin assembly,CHA)循环策略,实现对疾病标志物前列腺特异抗原(Prostate specific antigen,PSA)的分析检测。我们设计了以适配体为基础的触发链DNA(T)、封闭序列DNA(B)、发卡DNA(H1)、DNA(H3)和氨基修饰的DNA(H2)。在羧基CDs表面酰胺化偶联氨基修饰的发卡DNA(H2),当不存在PSA时,发卡DNA被氧化石墨烯(Graphene oxide,GO)吸附,CDs的荧光通过FRET被GO猝灭。当存在PSA时,会触发CHA循环,形成“Y”型的DNA双链结构,使其从GO上脱落,CDs的荧光强度随着PSA浓度的增加而逐渐恢复,并在1-100 ng/mL浓度范围内呈现良好的线性关系,检测限为0.22 ng/mL(3σ/k)。更重要的是,该FRET策略具有普遍适用性,通过适当改变相应靶物的识别序列,该方法还能实现疾病标志物癌胚抗原(Carcinoembryonic antigen,CEA)和生物小分子三磷酸腺苷(Adenosine triphosphate,ATP)的检测,检测限分别达到0.56 ng/mL(3σ/k)和80 nM(3σ/k)。因此,该方法提供了一个通用型的检测平台,并且具有优良的选择性,对临床上疾病的早期诊断和治疗具有重要意义。3.以CDs和量子点(Quantum dots,QDs)为能量供体,并结合杂交链式反应(Hybridization chain reaction,HCR)循环策略实现双靶物microRNA(miRNA)的同时分析检测。我们设计了发卡DNA(H1)和氨基修饰的发卡DNA(H2)以及DNA(H3)和生物素修饰的发卡DNA(H4)。在羧基CDs表面酰胺化偶联上氨基修饰的发卡DNA(H2);在链霉亲和素修饰的QDs(Streptavidin-QDs,SA-QDs)上偶联生物素修饰的发卡DNA(H4)。当不存在miRNA-141和miRNA-21时,发卡DNA被GO吸附,CDs和QDs的荧光通过FRET被GO猝灭。当存在miRNA-141时,会触发DNA(H1)与CDs-DNA(H2)之间的HCR循环;当存在miRNA-21时,会触发DNA(H3)与QDs-DNA(H4)之间的HCR循环。反应形成的双链DNA结构从GO上脱落,CDs和QDs的荧光恢复,当用CDs的激发波长激发时,可同时得到CDs和QDs的信号发射峰。CDs、QDs的荧光强度恢复程度分别与miRNA-141、miRNA-21的浓度呈现良好的线性关系,线性范围都为0.1-10 nM,检测限分别为50 pM(3σ/k)和60 pM(3σ/k)。与单一疾病标志物检测相比,双靶物检测能避免假阳性结果的出现,提高疾病诊断的准确性。综上所述,本文制备了表面富含羧基官能团的CDs,并将该CDs作为构建FRET体系的能量供体,再结合DNA自组装循环策略,成功地实现了简单、快速、灵敏检测疾病标志物的目标。同时,建立的分析方法具有通用性,也能同时检测多种靶物,对阵列传感器的开发具有重要意义。本研究为CDs作为能量供体在疾病标志物中的分析检测提供了新思路,建立的方法提高了疾病诊断的准确性,具有分析操作过程简单和成本低等优势,对疾病早期诊断具有重要的临床意义。