研究背景随着肥胖型人口的增加、老龄化社会的加速和全民运动的开展,关节软骨损伤的发生率逐年上升。软骨缺损可继发骨关节炎（Osteoarthritis,OA）和引起关节疼痛,严重者肢体残障、劳动力丧失。OA已成为目前全球仅次于心脑血管病的第二大慢性致残性疾病,造成重大的家庭及社会经济负担。关节软骨由于无血管、神经、缺少干细胞或软骨祖细胞以及结构较为复杂,其磨损退变或缺损直径大于2 mm后几乎没有自我再生修复能力。临床现有的治疗手段主要包括自体/异体骨软骨移植术、骨髓刺激-微骨折术、自体软骨细胞移植术、胫骨高位截骨术、人工关节置换术、药物治疗如玻璃酸钠注射治疗和保守治疗如减少负重、适度锻炼等。虽然这些治疗手段能不同程度缓解疼痛和改善关节功能,然而也都存在一定的局限性,如取材部位有限、供体取材部位损伤、免疫排斥反应;修复后新生的软骨多为纤维软骨,其力学性能和生物学性能难以达到正常透明软骨水平;针对大面积的软骨缺损修复能力有限;难以逆转关节软骨的进一步退化和坏死等,因此,临床治疗效果并不能完全令人满意。软骨修复在临床骨科和运动医学领域仍然是一项巨大难题。组织工程学为软骨修复和再生提供了新的策略。水凝胶是一类具有三维网络结构的聚合物,具有良好的生物相容性、可调控的降解速率和良好的弹性,且因其理化性质与软骨细胞外基质相似而被广泛应用于软骨组织工程领域。普鲁兰多糖是一种不带电荷的线性多糖,可生物降解、无毒、无免疫原性和非致癌性。有研究表明普鲁兰多糖可以作为新的细胞粘附剂用于软骨修复,基于普鲁兰多糖的水凝胶也具有良好的生物相容性,有利于细胞生长和增殖。但其降解速度快,力学性能差,不能完全满足关节软骨修复的要求。合成聚合物可以实现大规模加工制造,并且很容易的控制和操控微观结构、力学强度和降解时间。结合合成聚合物和具有细胞识别位点的天然生物大分子材料制备复合水凝胶的概念已受到学者们极大的关注。聚乙二醇作为FDA批准的用于药物输送和组织工程的合成高分子材料,力学性能好,能支持软骨细胞和间充质干细胞的粘附和增殖,已被广泛用于软骨组织工程水凝胶的制备。据此,本论文的第一部分制备光交联型甲基丙酸烯普鲁兰多糖（Pul MA）/PEGDA复合水凝胶。研究了PEGDA对Pul MA/PEGDA复合水凝胶的力学性能、流变性能、降解速率、形态结构、溶胀平衡等理化性能的影响。选取骨髓间充质干细胞（BMSCs）作为种子细胞,研究其在水凝胶中的细胞生物学行为,通过细胞存活率、细胞增殖、糖胺聚糖含量和软骨相关基因的表达来评价Pul MA/PEGDA复合水凝胶用于软骨再生的能力。软骨组织工程已被广泛用于软骨缺损的再生修复研究,但是在支架材料的设计过程中很少考虑到支架材料所处炎性微环境的控制。由于软骨缺损会导致周围炎性因子如白细胞介素1（IL-6）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）、干扰素γ的升高,这些炎性因子会抑制种子细胞成软骨分化与降低软骨ECM的生成速率,严重干扰新组织的再生和长入,从而很难达到理想透明软骨的再生效果。因此在支架材料设计过程中对炎性微环境控制研究具有重要意义。据此,本论文第二部分在前一部分已经发现Pul MA/PEGDA复合水凝胶具有可调控的形貌结构、降解速率以及良好的力学性能基础之上,将抗炎肽KAFAK负载于金属有机框架（MOFs）材料内,再封装于Pul MA/PEGDA水凝胶内部,通过对抗炎肽KAFAK的长时间有效控制释放,调控软骨再生炎性微环境,达到更理想的软骨缺损修复效果。研究方法第一部分:基于光交联普鲁兰多糖/聚乙二醇复合水凝胶的构建及软骨再生修复研究1.Pul MA材料的合成及表征通过酯化反应对普鲁兰多糖进行甲基丙烯酸修饰,然后通过核磁氢谱（H1 NMR）和红外图谱（FT-IR）对制备的Pul MA进行结构鉴定。2.Pul MA/PEGDA复合水凝胶的制备及表征Pul MA和PEGDA溶液在光交联剂LAP的作用下,在紫外光照射下可以快速形成水凝胶。然后对制备的Pul MA/PEGDA复合水凝胶的理化性质包括形貌结构、溶胀能力、降解性能、流变学及力学性能进行表征。3.Pul MA/PEGDA复合水凝胶对兔BMSCs的封装、存活与增殖Pul MA/PEGDA复合水凝胶的预聚体在光交联剂LAP的作用下成胶并对兔BMSCs进行封装,细胞在水凝胶内部的三维空间中生长,培养过程中用显微镜对细胞的形态进行观察。采用Calcein-AM/PI Double Stain Kit对水凝胶内部的细胞进行活/死细胞染色。4.Pul MA/PEGDA复合水凝胶中糖胺聚糖含量测定通过对含有BMSCs的Pul MA/PEGDA复合水凝胶用成软骨诱导培养基培养7d和14d后,对各组水凝胶进行糖胺聚糖含量测定,然后将糖胺聚糖含量用对应组的DNA含量进行均化计算。5.Pul MA/PEGDA复合水凝胶中软骨标志物（COL2A1、ACAN和SOX9）和肥大表型基因（COL10A1）的含量表达为了比较Pul MA、Pul MA/PEGDA和PEGDA水凝胶维持成软骨表型的能力,对软骨特异性标志物COL2A1、ACAN和SOX9基因和肥大标志物COL10A1基因分别在成软骨培养基中培养7d和14d后用RT-PCR方法进行定量检测。6.Pul MA/PEGDA复合水凝胶皮下包埋实验为了比较Pul MA、Pul MA/PEGDA和PEGDA水凝胶在体内的降解情况和生物安全性,将三种水凝胶包埋于小鼠皮下28d后观察其降解情况,并用HE染色验证生物安全性。第二部分:负载抗炎肽的锆-金属有机框架封装于水凝胶促进软骨细胞外基质生成的研究1.制备的纳米锆-金属有机框架（Zr MOF）和Zr MOF@KAFAK材料的表征采用热溶法实现对纳米Zr MOF材料成功制备,采用扫描电镜、透射电镜及粒径分析对产物的形貌结构和粒径大小进行观察分析。2.封装有纳米Zr MOF材料的Pul MA/PEGDA复合水凝胶的表征结果将纳米Zr MOF材料混合在Pul MA和PEGDA溶液中,在光交联剂LAP的协助下,经紫外光照射快速形成水凝胶。然后对制备的封装有纳米Zr MOF材料的Pul MA/PEGDA复合水凝胶的理化性质包括红外图谱、形貌结构（元素能谱分析）、溶胀能力、降解性能、流变学性能进行表征。3.封装有纳米Zr MOF材料的Pul MA/PEGDA复合水凝胶对兔BMSCs的封装、存活与增殖封装有纳米Zr MOF材料的Pul MA/PEGDA复合水凝胶的预聚体在光交联剂LAP的作用下成胶并对兔BMSCs进行封装,分别为Gel组、Gel-100 Zr MOF组和Gel-100 Zr MOF@KAFAK组,细胞在水凝胶内部的三维空间中生长。为了研究封装有纳米Zr MOF材料的Pul MA/PEGDA复合水凝胶的生物安全性,采用Calcein-AM/PI Double Stain Kit对水凝胶内部的细胞进行活/死细胞染色。4.封装有纳米Zr MOF材料的Pul MA/PEGDA复合水凝胶中糖胺聚糖含量测定通过对含有BMSCs的封装有纳米Zr MOF材料的Pul MA/PEGDA复合水凝胶在成软骨诱导培养基中培养7d和14d后,对各组水凝胶进行糖胺聚糖含量测定,然后将糖胺聚糖含量用对应组的DNA含量进行均化计算。5.封装有纳米Zr MOF材料的Pul MA/PEGDA复合水凝胶中软骨标志物（COL2A1和ACAN）和肥大表型（COL10A1）的含量表达为了比较Gel组、Gel-100 Zr MOF组和Gel-100 Zr MOF@KAFAK组水凝胶维持成软骨表型的能力,对软骨特异性标志物COL2A1和ACAN基因和肥大标志物COL10A1基因分别在成软骨培养基中培养7 d和14 d后采用RT-PCR方法进行定量检测。研究结果第一部分:基于光交联普鲁兰多糖/聚乙二醇复合水凝胶的构建及软骨再生修复研究1.H1NMR图和FT-IR图结果表明甲基丙烯酸基团被成功接枝到普鲁兰多糖分子上,甲基丙烯酸化程度为10%。2.通过对制备的Pul MA/PEGDA复合水凝胶的理化性质包括形貌结构、溶胀能力、降解性能、流变学及力学性能进行表征,结果显示PEGDA的引入不仅对水凝胶体系的形貌结构、溶胀性能和降解性能进行调节,同时还能提高水凝胶体系的流变学及力学性能。证明制备的Pul MA/PEGDA复合水凝胶具备可调控的理化性质。3.以兔BMSCs作为种子细胞,活/死细胞染色表明Pul MA组、Pul MA+15%PEGDA组和PEGDA组内绝大多数细胞都处存活状态,说明制备的水凝胶没有明显的细胞毒性。4.通过对软骨ECM糖胺聚糖检测,Pul MA/PEGDA水凝胶具有更好的促进BMSCs分泌软骨ECM的能力。5.通过RT-PCR检测软骨特异性标志物COL2A1、ACAN和SOX9,在Pul MA/PEGDA水凝胶中均有比较高的表达,表明Pul MA/PEGDA复合水凝胶有维持软骨表型的能力。6.水凝胶植入小鼠皮下28d后,无水肿或中性粒细胞浸润的迹象,说明植入的水凝胶支架材料未引起急性或慢性炎症,进一步说明Pul MA/PEGDA复合水凝胶在体内具有良好的组织相容性。第二部分:负载抗炎肽的锆-金属有机框架封装于水凝胶促进软骨细胞外基质生成的研究1.通过热溶法完成对纳米Zr MOF材料的制备,通过透射电镜和扫描电镜观察到制备的纳米Zr MOF材料呈长梭形,分布均一。通过粒径分析仪检测得水合粒径为332.03±37.75 nm,Zeta电位为-23.77±3.33 m V。抗炎肽KAFAK被负载到纳米Zr MOF材料后（Zr MOF@KAFAK）,其水合粒径为350.50±8.19 nm,Zeta电位为18.27±0.55 m V。2.通过对封装有纳米Zr MOF材料的Pul MA/PEGDA复合水凝胶的理化性质包括形貌结构、溶胀能力、降解性能及流变学性能的表征,结果显示纳米Zr MOF材料的引入能对水凝胶体系的形貌结构、溶胀性能、降解性能及流变学进行调节。3.Pul MA/PEGDA复合水凝胶封装Zr MOF@KAFAK后能实现对抗炎肽KAFAK的长时间释放达21d。4.通过IL-1β预处理的培养基模拟炎性微环境。通过对成软骨能力的关键指标糖胺聚糖含量测定,Pul MA/PEGDA复合水凝胶封装Zr MOF@KAFAK后,其体系中的BMSCs具有更高的软骨ECM分泌的能力。5.RT-PCR对软骨特异性标志物COL2A1和ACAN以及肥大化标志物COL10A1基因的表达进行测定,结果显示COL2A1和ACAN在Gel-100 Zr MOF@KAFAK组水凝胶中都具有比较高的表达,而肥大基因在Gel-100 Zr MOF@KAFAK组水凝胶中的表达量降低,表明Gel-100 Zr MOF@KAFAK组水凝胶通过缓慢释放抗炎肽KAFAK从而有利于维持成软骨表型和抑制BMSCs肥大化。研究结论1.成功制备光交联的天然高分子材料普鲁兰多糖和合成高分子材料PEGDA的复合水凝胶,整个体系的理化性质可以通过改变PEGDA的浓度进行调控。2.包裹于Pul MA/PEGDA复合水凝胶内部的BMSCs,具有良好的细胞活性、更多的ECM糖胺聚糖分泌和维持成软骨表型的能力,该水凝胶为软骨组织工程提供一种新型复合水凝胶体系。3.成功将纳米Zr MOF材料封装于Pul MA/PEGDA复合水凝胶内部,整个体系的理化性质可以通过改变纳米Zr MOF材料进行调控。4.完成纳米Zr MOF材料对抗炎肽KAFAK的负载（Zr MOF@KAFAK）,Zr MOF@KAFAK再被封装于Pul MA/PEGDA水凝胶,可以实现对抗炎肽KAFAK的长时间控制释放。5.通过调控炎性微环境可以达到更好的软骨再生效果,为构建兼具软骨再生和炎性微环境调控的支架材料用于软骨组织工程提供一种新策略。