牛胚胎体外生产技术包括卵母细胞体外成熟、体外受精、体外培养及冷冻保存等环节。本试验对牛卵母细胞及体外胚培养技术进行了研究,比较系统地掌握了牛卵母细胞的操作技术,为该技术的深入研究和应用铺垫了良好基础。1、卵母细胞体外成熟技术(1)COCs级别对卵母细胞成熟的影响。选择A、B、C和D级COCs进行成熟培养。A级成熟率为63.81%,B级为47.81%,C级为2.01%,D级为0.00%,各级成熟率之间差异显著(p<0.01),A、B级远高于C、D级。C级仅有个别发育成熟,D级未见成熟。因此,A、B级COCs是卵母细胞体外培养的主要资源,宜选择A、B级COCs进行成熟培养。(2)卵泡直径对卵母细胞成熟的影响。将卵泡分为3级:大卵泡(φ>8mm)、中卵泡(2mm≤φ≤8mm)和小卵泡(φ<2mm)。COCs成熟率分别为大卵泡组17.07%、中卵泡组61.82%、小卵泡组19.06%,中卵泡组显著高于大卵泡组和小卵泡组(p<0.01),大卵泡组和小卵泡组差异不显著(p>0.05)。卵母细胞的成熟率与采集COCs时的卵泡直径关系密切,在卵母细胞体外培养过程中,宜选择卵巢发育正常的卵泡采集,不宜选择发育过大或过小的边际卵泡。2、牛卵母细胞体外受精技术(1)直接离心法对获能效果和卵母细胞受精率的影响。①二次离心沉淀液:对第一次离心的沉淀定容后继续离心后获得的沉淀进行活力、获能效果和受精率测定。洗涤精子最终活力为0.44;获能效果以10min时最高,为0.41,15min时为0.32,超活化以15min时最好;受精率为40.19%。②二次离心上清液:对第一次离心的上清液定容后继续离心后获得的沉淀进行测定。洗涤精子最终活力为0.56;获能效果以10min时最高,为0.59,15min时较低,为0.585,超活化也以15min时最好;受精率为43.21%。二次离心上清液的各项指标显著高于沉淀液(p<0.01)。从试验结果看,宜选用上清液15min组的获能精子进行体外受精。本试验突破了精子离心法的传统方法,避开了单纯利用沉淀液进行精子获能的思路,而直接对上清液进行离心处理,获得了理想的精子洗涤和获能效果。(2)不同温度对精子获能和卵母细胞受精的影响。将精子分别在20～24℃室温和38.5℃恒温(CO2培养箱)上浮60min、获能10～20min。①室温上浮法:超净工作台上浮60min,精子活力以45min时最高,达到0.68;对上浮45min的精子获能15min后进行体外受精,平均受精率41.40%。②恒温上浮法:CO2培养箱上浮60min,精子活力30min时最高,达到0.697;对上浮30min的精子获能15min后进行体外受精,平均受精率41.51%。精子获能后的超活化现象与室温法一致。二种不同上浮方法的精子活力和受精率之间差异不显著(p>0.05),恒温上浮法的效果略高于室温组。从可控角度考虑,还以恒温上浮法为宜。(3)精子浓度与受精的关系。使用不同浓度(低1.0×106、中1.5×106和高3.0×106个/ml)精子与卵子共同孵育。中浓度组平均受精率为47.34%,显著高于低浓度组的42.38%(p<0.05)和高浓度组的33.96%(p<0.01);低浓度组的平均受精率显著高于高浓度组平均受精率(p<0.01)。本试验表明精子适宜浓度宜控制在(1.0～1.5)×106个/ml。3、牛体外受精胚胎培养技术(1)卵丘细胞、卵丘细胞+bFF共培养系统对胚胎发育的影响。卵丘细胞组、卵丘细胞+bFF组和对照组的桑椹胚率分别为29.07%、34.99%和26.67%;囊胚率分别为8.51%、10.63%和7.24%。卵丘细胞+bFF组的桑囊率显著高于卵丘细胞组和对照组(p<0.01)。本试验通过添加卵丘细胞、卵丘细胞+bFF共培养物质,较好地克服了2C发育阻滞。(2)培养液体积对胚胎发育的影响。分别用50μl和500μl培养液培养胚胎。50μl液滴的桑椹胚率为33.14%,囊胚率为9.07%,500μl液滴依次为36.23%和10.23%。大体积培养比微滴培养有优势,桑椹胚和囊胚率均较高(p<0.01)。本项试验中500μl的效果好于50μl。4、卵母细胞冷冻保存技术及解冻培养(1)程序化一步法冷冻时10%GL和10%EG对COCs冷冻效果的影响。COCs在液氮保存1周后解冻成熟培养。EG组成熟率为34.46%,桑椹胚率为11.18%,囊胚率为4.18%;GL依次为33.44%、10.56%和3.86%。EG组的成熟率比GL组高3.05%(p>0.05),桑椹胚率高5.87%(p>0.05),囊胚率高8.29%(p>0.05)。冷冻保护剂GL和EG均可用于COCs的冷冻保存,但EG的效果比较好。(2)玻璃化冷冻时麦管和OPS管对COCs冷冻效果的影响。以麦管和OPS管作为冷冻载体,二步法玻璃化冷冻COCs。对冷冻1周后的COCs解冻培养,麦管法成熟率为29.84%,桑椹胚率为9.34%,囊胚率为3.47%;OPS法依次为31.89%、9.66%和3.80%。OPS法的成熟率比麦管法高6.87%(p>0.05),桑椹胚率高3.43%(p>0.05),囊胚率高9.51%(p>0.05)。OPS管玻璃化冷冻的效果优于麦管法,但无统计差异,而麦管法宜于操作和储存,宜在实际操作中选用麦管法。(3)COCs冷冻方法的比较。COCs的4种处理方法在成熟培养、桑椹胚发育和囊胚发育方面的趋势基本一致,整体效果的优势序列为EG法>GL法>OPS管法>麦管法。玻璃化冷冻效果低于程序化一步法冷冻法。由于玻璃化冷冻的解冻处理程序复杂,建议实际应用时选用麦管程序化一步法冷冻法。5、小结通过牛卵母细胞体外培养技术试验的实施,比较系统地掌握了牛卵母细胞成熟培养、精子获能、体外受精和体外培养的技术环节和操作程序,利用共培养系统突破了2C发育阻滞,在精子获能方面建立了新的洗涤和获能方法。本研究的技术指标在同类研究中属于较高水平,在将后研究中将进一步探索和提高。