不同构象的钛-细胞双靶向肽生物功能比较的研究

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目的:钛种植体由于其良好的生物匹配以及骨组织结构相似的机械性能,被广泛用于口腔临床种植。为提高钛种植体的骨整合质量与速度,适应口腔内复杂的受力环境,采用RGD对钛表面进行涂层修饰各种研究成为研究热点,而钛表面结合肽这一新兴生物连接方式近年来也备受关注。本研究旨在模拟口腔轻力负载的环境下,应用具有钛特异性识别结合能力的RKLPDA序列(TBP)将RGD序列固定于钛表面,对融合肽进行多种策略设计,设计出了TBP和RGD不同的连接方式以及功能性重复的一系列融合肽,探讨融合肽-应力双重作用下基因差异表达和细胞的生物学活性差异,探寻能提高种植体与周围骨组织的骨整合的高效融合肽。  方法:实验所设计的融合肽均基于RGD(PRGDN)和钛特异性识别TBP(RKLPDA)基序单位,我们进行了3种不同连接方式的对比设计,即:(1)直接连接为TBP-RGD和通过肽连接体GGG连接的TBP-GGG-RGD;(2)直线构象TBP-linearRGD和环状构象TBP-cyclicRGD;(3)不同功能性重复2TBP-RGD和TBP-2RGD。实验第一部分涉及构成单元RGD和TBP以及融合肽TBP-RGD和TBP-GGG-RGD,我们通过多肽在钛表面的吸附实验,研究特定浓度下不同多肽在钛片表面的结合能力;通过对多肽修饰后生长的细胞进行梯度压力加载(RCF=30g,90g,180g)后检测细胞特定基因(Cbfα-1,c-fos)表达从而确定出适宜大小的生物力负载;进行比较通过细胞、粘附、伸展、增殖相关实验完成了在负载条件下多肽的细胞生物反应的比较。  实验第二、三部分涉及多肽TBP-RGD、2TBP-RGD、TBP-2RGD、TBP-linearRGD、TBP-cyclicRGD,利用石英晶体微天平(QCM-D)证明了不同功能性重复构象的融合肽于钛表面的特异性识别的差异,在负载条件下探索多肽对成骨细胞在钛片上的粘附、伸展、增殖的影响。  结果:实验第一部分:确定了100μmol/L为多肽最佳粘附浓度;析出实验显示不同多肽在钛表面特异性识别能力:TBP-RGD>TBP>RGD>TBP-GGG-RGD;不同连接方式TBP-RGD和TBP-GGG-RGD在梯度压力加载(RCF=30g,90g,180g)下细胞的特定基因(Cbfα-1,c-fos)表达均发生了显著性差异,30g为适宜大小的促进生物反应的力;TBP-RGD比TBP-GGG-RGD更有利于钛结合和细胞粘附增殖反应。实验第二、三部分:QCM显示钛识别能力依次排序:TBP-cyclicRGD>TBP-RGD>TBP-linearRGD,2TBP-RGD>TBP-RGD>TBP-2RGD,促细胞生物反应同多肽钛识别能力不一致。  结论:不同设计策略的融合肽在钛表面的特异性识别和结合力不一样,重复TBP的2TBP-RGD有利于钛识别能力,环状TBP-cyclicRGD比线性TBP-linearRGD显著提高了多肽的钛识别能力;不同设计策略的融合肽细胞生物学反应也不一样,重复RGD不利于细胞生物学反应,直接连接策略下的TBP-RGD融合肽有利于提高成骨细胞生物学反应。最终挑选出了同时具有良好的Ti识别能力和促反应能力的双向生物功能的融合肽TBP-RGD,为“双靶向”融合肽涂层动物体内实验提供基础。
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