乳腺上皮细胞是乳汁合成的主要场所,与乳产量和乳品质密切相关。乳腺上皮细胞在生理及病理阶段,易发生氧化应激。抵御乳腺上皮细胞的氧化应激和增强其抗氧化能力是维持乳腺健康和高效泌乳的有效手段。白藜芦醇是一种高效的抗氧化剂,大量研究发现了它的保健和治疗功效,然尚无研究将其用于健康的乳腺抗氧化研究。本研究首先采用H2O2刺激MAC-T细胞构建了奶牛乳腺上皮细胞氧化应激模型,评价了白藜芦醇抵御乳腺上皮细胞氧化应激的效果。然后利用分子生物学手段探索了白藜芦醇通过Nrf2-ARE信号通路、MAPK及PI3K/AKT等信号通路对乳腺上皮细胞抵御氧化应激的保护作用机理。最后通过向哺乳期ICR小鼠日粮中添加低剂量及高剂量的白藜芦醇检测白藜芦醇在哺乳期饲喂的安全性,并明确其对乳腺的氧化还原平衡及对Nrf2-ARE信号通路的调控作用。主要研究结果如下：1.白藜芦醇保护奶牛乳腺上皮细胞抵御H2O2诱导的氧化损伤1.1构建H2O2诱导的奶牛乳腺上皮细胞氧化应激模型。采用了不同浓度不同时间的H2O2刺激MAC-T检测细胞增殖、细胞死亡率、ROS蓄积情况、细胞的氧化平衡情况、细胞内线粒体损伤(BAX和BCL2)和内质网损伤指标(GPR78和CHOP)基因的表达变化,结果发现500μM H2O2处理MAC-T细胞24 h可以引起显著地细胞活力损失,导致细胞凋亡发生,处理MAC-T细胞12 h引起显著地ROS过量产生,并伴随着总抗氧能力和超氧化物歧化酶活性的下降,500μM H2O2处理导致GPR78和CHOP基因表达在4h达到最大,BAX/BCL2最大值则在24h出现。由此确定500μM以上H2O2处理MAC-T细胞引起细胞氧化损伤,主要表现为细胞活力损伤、细胞死亡加剧、氧化还原平衡被破坏,并伴随着线粒体及内质网损伤,并在后续研究中采用500μM H2O2处理MAC-T细胞构建氧化应激损伤模型。1.2明确白藜芦醇对H2O2诱导的奶牛乳腺上皮细胞氧化损伤的保护效果。采用不同浓度白藜芦醇处理MAC-T细胞确定MAC-T 24 h内能够耐受的白藜芦醇的最高浓度是S0μM。接着基于前期构建的氧化应激模型,采用50μM以下不同浓度的白藜芦醇或溶剂对照预处理2h而后加入H2O2或PBS的处理特定时间来检测细胞增殖、细胞死亡率、ROS蓄积情况、细胞的氧化平衡情况、细胞内线粒体损伤(BAX和BCL2)和内质网损伤指标(GPR78和CHOP)基因的表达变化。结果发现,较之H2O2处理,白藜芦醇预处理后再加入H2O2的细胞活力损失、细胞凋亡率、细胞内的ROS蓄积程度随白藜芦醇的浓度的增加而下降。而且白藜芦醇的添加增加了细胞的总抗氧化能力。50μM白藜芦醇削弱了H2O2诱导的线粒体损伤和内质网损伤。结果显示白藜芦醇可以保护乳腺上皮细胞抵御H2O2诱导的氧化损伤2.白藜芦醇保护乳腺上皮细胞抵御H2O2诱导的氧化损伤的作用机制2.1检测白藜芦醇及H2O2处理对奶牛乳腺上皮细胞中Nrf2-ARE-抗氧化酶链的作用。首先检测白藜芦醇和H2O2单独/组合处理MAC-T后细胞内的抗氧化关键基因XNRD1、 HO-1、XCT、NQO-1的表达丰度变化,发现白藜芦醇预处理后无论是否有H2O2刺激,细胞内的抗氧化关键基因表达在特定的时间内均被激活表达,且较之H2O2单独处理组,白藜芦醇+H2O2处理的抗氧化基因均在8h显著增强。采用不同浓度白藜芦醇处理细胞后加入H2O2刺激发现白藜芦醇对于抗氧化基因的表达具有剂量依赖性,有报道证实这些基因是Nrf2-ARE信号通路的靶基因。接着我们检测发现白藜芦醇促进了H202处理下Nrf2蛋白的核转移程度,并促进了细胞内的ARE原件的激活。由此证实白藜芦醇激活了细胞内的Nrf2-ARE-抗氧化链。2.2明确白藜芦醇依赖Nrf2发挥奶牛乳腺细胞保护作用。通过siRNA沉默Nrf2基因表达后重新评估白藜芦醇的保护效果,研究发现细胞内的Nrf2-ARE-抗氧化链的关键靶基因表达在H2O2和白藜芦醇+H2O2处理中均被抑制。而且siRNA沉默Nrf2基因表达后白藜芦醇预处理不能保护细胞免受H2O2诱导的细胞活力损失,甚至siRNA沉默Nrf2基因表达后H2O2处理导致的内质网应激加剧。由此得出白藜芦醇是通过Nrf2-ARE信号通路实现保护乳腺上皮细胞的作用的。2.3探索白藜芦醇通过MAPK、PI3K/AKT信号通路对Nrf2-ARE信号通路激活的作用。检测白藜芦醇及H2O2单独/组合处理MAC-T后细胞内AKT、ERK1/2、JNK1/2、p38的磷酸化水平的时间剂量作用,结果发现H202单独处理激活了所有上述信号转导关键蛋白的活化,而白藜芦醇预处理则延长了AKT及ERK1/2的磷酸化时间。后期采用抑制剂预处理抑制细胞内PI3K/AKT、ERK1/2、JNK1/2、p38信号通路的激活,再采用白藜芦醇及H2O2单独/组合处理发现白藜芦醇可能是通过EKR、PI3K/AKT信号通路激活Nrf2-ARE信号通路实现保护乳腺上皮细胞的作用,而p38信号通路则抑制了白藜芦醇对Nrf2-ARE信号通路的激活作用及细胞保护作用的发挥。3.日粮添加白藜芦醇对哺乳期小鼠乳腺氧化损伤及生产性能的影响该部分采用单因素多水平试验探索了日粮中添加白藜芦醇对哺乳期ICR小鼠乳腺的抗氧化作用,白藜芦醇的添加剂量为0、0.02%、0.2%。通过母鼠采食量、体重、器官分数、乳腺重量变化发现白藜芦醇的添加不会对母鼠这些指标造成负面影响,通过间接法评估乳产量也未发现白藜芦醇具有促进乳产量的作用。对仔鼠的窝重,日增重及器官发育分数检测发现白藜芦醇不会对仔鼠以上发育指标产生负面作用,提示哺乳期食入一定剂量白藜芦醇是安全的。通过采集母鼠的乳腺、肝脏、肾脏等器官检测器官总抗氧化能力、脂质过氧化物、超氧化物歧化酶酶活力,发现白藜芦醇的添加显著降低了泌乳期ICR小鼠乳腺中的脂质过氧化程度,减少氧化损伤,而对肝脏和肾脏则无上述效果。同时对乳腺的抗氧化基因mRNA表达的检测发现,0.2%白藜芦醇添加的小鼠乳腺中SOD2、GPX1、PRX1、TXNRD1的基因表达显著上调,而0.02%以上的白藜芦醇添加小鼠乳腺中TXNRD1、HO1、Nrf2蛋白表达均显著上调,提示日粮添加白藜芦醇可以减少哺乳期小鼠乳腺氧化损伤,促进Nrf2-ARE-抗氧化链信号通路。综上所述,本研究成功构建了奶牛乳腺上皮细胞氧化应激模型,利用此模型研究了白藜芦醇在乳腺上皮细胞中的抗氧化损伤作用及其机制,并采用在体实验证实了白藜芦醇的乳腺保护作用及其对Nrf2-ARE-抗氧化链的调节作用。其中Nrf2-ARE-抗氧化链在乳腺抗氧化应激和细胞存活中发挥重要作用,白藜芦醇可能通过PI3K/AKT、ERK通路影响Nrf2-ARE-抗氧化链从而调控乳腺中的氧化还原平衡。本研究也为白藜芦醇在奶牛乳腺保护中的应用提供研究基础及提示。