子宫平滑肌瘤(Uterine leiomyomas，UtLM)，也称为子宫肌瘤，是好发于女性子宫平滑肌的良性肿瘤，同时也是育龄妇女行子宫切除手术的首要原因。近年来，环境中广泛存在的雌激素干扰物在子宫肌瘤发生中的影响引起了学术界的关注。人群流行病学资料以及动物实验研究发现低剂量雌二酚(diethylstilbestrol，DES)暴露可导致包括子宫肌瘤在内的多种女性生殖系统疾病。而低剂量DES在发育早期的暴露更被认为与子宫肌瘤的发生直接相关。已经有动物实验结果支持这样的假设：发育早期的环境雌激素干扰物暴露同样可以引起类似于DES样的作用，在较后的生存期出现子宫肌瘤。在已确认的环境雌激素中，大豆异黄酮(genistein，Gen)是一种广泛存在于大豆及其制品中的、具雌激素活性的、有代表性的植物雌激素，可自食物中摄入。其对怀孕妇女和新生婴儿的健康危害近年来已引起越来越多的重视。现已证实新生雌性小鼠(CD-1)暴露于环境相关剂量(0.5-50毫克每公斤每天)的Gen可导致生殖系统危害，包括不正常的卵巢发育、发情周期延长、不育以及子宫肿瘤等。然而其对子宫平滑肌的影响以及可能参与的机制尚未见报道。由于Gen广泛存在于各种以大豆为原料的食品中，特别是一些用以喂养婴儿的豆乳替代品。因此，以Gen为代表来阐明膳食中植物雌激素早期暴露或其它环境雌激素活性物质对子宫肌瘤发生的影响具有重要意义。本研究旨在(1)利用整体实验探讨参与Gen发育暴露引起CD-1小鼠发生子宫肌瘤的可能分子机制；(2)利用体外实验阐明Gen对人子宫平滑肌瘤细胞和正常子宫平滑肌细胞的剂量效应关系；(3)鉴别人子宫平滑肌瘤细胞在高低不同剂量Gen作用下中有显著性表达差异的基因，并对可能参与的信号通路进行研究；(4)探讨低剂量Gen引起人子宫平滑肌瘤细胞而非正常子宫平滑肌细胞增生的机制，为阐明环境雌激素对子宫肌瘤的发生、发展的影响提供实验依据。本研究结果可提高我们对环境雌激素暴露对子宫平滑肌瘤生长影响的认识，可为外源性和内源性雌激素造成子宫平滑肌瘤生长提供新的解释，可为进一步研究子宫平滑肌瘤生长的表遗传机制提供理论依据。第—部分雌性(CD-1)小鼠大豆异黄酮新生暴露引起雌激素受体-alpha和胰岛素样生长因子-Ⅰ受体在子宫肌瘤中表达升高为进一步探讨可能参与Gen发育暴露引起子宫肌瘤的发生的分子机制，我们将新出生CD-1小鼠(1.6±0.04 g)随机分成对照组和染毒组。染毒剂量为：对照组0 mg／(kg·d)、低剂量组0.5mg／(kg·d)、中剂量组5mg／(kg·d)和高剂量组50mg／(kg·d)，从出生后第一天开始染毒，每天皮下注射，连续染毒5天。分别于12个月和18月后处死小鼠，按实验需要分离子宫等脏器。随后对子宫进行处理，包埋，切片。根据对组织切片的形态学观察以及免疫组化染色，我们发现：1．在中剂量组5mg／(kg·d)和高剂量组50mg／(kg·d)暴露组，雌性小鼠(CD-1)在12个月和18月时出现肿瘤。但是对照组0 mg／(kg·d)和低剂量组0.5mg／(kg·d)组的子宫平滑肌未发现有子宫肿瘤的发生。2．免疫组化染色结果表明ERα、磷酸化ERα、IGF-I、IGF-IR以及磷酸化MAPK P44／42在子宫平滑肌瘤的表达量明显高于正常子宫平滑肌组织中的蛋白表达量。结论：以上结果表明，雌性小鼠(CD-1)Gen新生暴露可在生长后期引起子宫平滑肌瘤的发生，并且肌瘤的发生与染毒剂量有关。ERα、磷酸化ERα、IGF-I、IGF-IR以及磷酸化MAPK P44／42在子宫平滑肌瘤的表达升高提示Gen新生暴露可能干扰了ERα和IGF-IR信号转导通路，并且ERα和IGF-IR信号转导通路可能直接参与子宫平滑肌瘤的生长。本研究同时提示Gen虽为弱雌激素物质，早期婴儿喂养豆奶配方应引起关注。第二部分大豆异黄酮对体外培养人子宫平滑肌瘤细胞和正常子宫平滑肌细胞的生长影响妇女是否因食物摄入大豆异黄酮(Gen)而造成对子宫平滑肌或已有子宫平滑肌瘤的影响?利用培养的人子宫平滑肌瘤细胞和正常子宫平滑肌细胞，我们评价了Gen在0.001-50μg／ml浓度内，对这两种细胞的生长影响。我们用光镜观察了细胞的形态学改变；用MTS方法测定了细胞增生效应；用免疫细胞化学对增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)进行了染色；用流式细胞仪观察了细胞周期；用荧光测定和激光共聚焦方法，对caspase-3活性及凋亡小体进行了测定。主要结果如下：1．低剂量(0.001-1μg／ml)Gen对子宫平滑肌瘤细胞有显著的增生促进作用，细胞保持了固有的长条形特征。细胞核PCNA染色增加。S-期细胞数增多。但是在Gen低剂量作用下，正常子宫平滑肌细胞没有出现以上改变。2．高剂量(10-50μg／ml)Gen作用下，子宫平滑肌瘤细胞和正常子宫平滑肌细胞的生长均受到明显抑制，细胞形态被破坏，细胞核PCNA染色减少。与低剂量和对照处理组相比，在高剂量Gen处理下两种细胞G2／M期细胞比例升高，G1期细胞比例降低，caspase-3活性升高，出现细胞凋亡。结论：Gen对子宫平滑肌瘤细胞和正常子宫平滑肌细胞呈现剂量依赖关系。低剂量Gen仅能引起人子宫平滑肌瘤细胞的增生效应。而在高剂量条件下，Gen能够改变子宫平滑肌瘤细胞和正常子宫平滑肌细胞两种的细胞形态，抑制细胞增生，升高caspase-3活性，引起细胞凋亡。而且，后两种作用在正常子宫平滑肌细胞上更明显。第三部分毒理基因组学分析体外培养子宫平滑肌瘤细胞在大豆异黄酮作用下基因表达谱以及高剂量作用的机制研究为探讨Gen对人子宫平滑肌瘤细胞的影响及作用机制，我们用Agilent Whole Human Genome arrays分析了子宫平滑肌瘤细胞在两个特定浓度低(1μg／ml)和高(50μg／ml)的Gen作用下，基因表达谱的改变特征。并且用Ingenuity Pathway Analysis(IPA)分析软件，我们对筛选出的特征基因作了进一步分析。依据Ingenuity Pathways Knowledge Base提供的数据，这些特征基因被构建为特定基因网络、功能和信号通路。我们对高浓度Gen引起子宫平滑肌瘤细胞抑制作用的机制作了深入研究。用实时反转录聚合酶链反应(real-time RT-PCR)和蛋白免疫印记分析方法(Western blotting)，我们验证了特定通路中感兴趣的基因。在此基础上，我们还在16个子宫平滑肌瘤病人组织样本中对这些基因的蛋白表达进行了验证。主要结果如下：1．低浓度(1μg／ml)Gen对子宫平滑肌瘤细胞增生作用的基因表达谱的改变主要为：(1)有27个基因表达发生了显著改变(以1.5倍为标准，P＜or=0.001)。(2)IPA软件分析显示这些基因主要分布在与细胞间信号与作用、细胞活动、细胞形态、细胞的功能和维持，以及细胞增生相关的功能中，而参与的主要信号通路包括cardiacβ-adrenergic，Wnt／β-catenin，TGF-β以及磷酸肌醇代谢通路。(3)我们选定了参与了这些功能和信号通路中的上调基因，A-myb，activin B，HOXA10，EDN1和ID3，以及下调基因MMP1，RGS2，PLN和PLAT作为进一步研究参与增生的分子机制的候选基因。2．高浓度(50μg／ml)Gen引起的子宫平滑肌瘤细胞基因表达谱改变：(1)有541个基因表达发生了显著改变(以1.5倍为标准，P＜or=0.001)。(2)IPA软件分析显示这些基因主要分布在与细胞周期、细胞死亡、细胞生长和分化相关的功能中，参与的主要信号通路包括integrin，VEGF，嘌呤代谢，TGF-β和fatty acid biosynthesis(通路2)。(3)在TGF-β信号通路中，Activin A，activin B，Smad3 and TGF-β2基因表达水平均被下调。同时，一些与细胞周期调节有关的基因如CDK6，A-myb和Cyclin B2也被下调了，而P15，一个CDK抑制基因被上调了。(4)用real-time RT-PCR和Western blotting我们进一步验证了ActivinA和Smad3在高浓度(50ug／ml)Gen作用的子宫平滑肌瘤细胞中的表达水平。(5)与Activin A蛋白降低相一致，我们发现Activin A能促进子宫平滑肌瘤细胞增生，并能部分拮抗Gen对子宫平滑肌瘤细胞的抑制作用。(6)在子宫平滑肌瘤病人组织样本中Activin A和Smad3的蛋白要比相匹配的正常平滑肌组织要高，从而进一步支持ActivinA和Smad3可能参与促进了子宫平滑肌瘤生长。结论：以上结果表明，Activin A和Smad3基因参与了低(1ug／ml)、高(50ug／ml)浓度的Gen对子宫平滑肌瘤细胞的不同作用。Activin A和Smad3的表达升高可能促进了子宫平滑肌瘤生长。高浓度(50μg／ml)Gen对子宫平滑肌瘤细胞的抑制作用可能通过破坏细胞周期调节，以及部分通过对TGF-β通路中Activin A和Smad3的下调起作用。第四部分低剂量大豆异黄酮对体外培养人子宫平滑肌瘤细胞增生的分子机制-促进雌激素受体-alpha和胰岛素样生长因子-Ⅰ受体之间的相互作用低剂量Gen可引起人子宫平滑肌瘤细胞增生，而非子宫平滑肌细胞。为探讨人子宫平滑肌瘤细胞在低浓度Gen作用下增生的分子机制，我们选取浓度为1μg／ml的Gen研究了人子宫平滑肌瘤细胞对于子宫平滑肌细胞的高应激性机制。使用雌激素反应元件报告基因，我们发现Gen对子宫平滑肌瘤细胞的转录活性要高于子宫平滑肌细胞。与此相一致，利用实时反转录聚合酶链反应我们发现在低浓度Gen作用下，子宫平滑肌瘤细胞中PR和IGF-Ⅰ的mRNA表达水平比子宫平滑肌细胞高，但雌激素受体两种亚型(ERα和ERβ)的mRNA表达水平在两种细胞中均没有明显改变。使用蛋白免疫印记方法，我们对两种细胞在Gen作用下雌激素受体两种亚型(ERα和ERβ)、磷酸化的ERK和Shc在Gen的蛋白表达作了进一步验证。结果显示仅在子宫平滑肌瘤细胞中出现ERα蛋白表达减低以及早期的ERK和Shc的激活；而子宫平滑肌细胞并未出现上述改变。另外，使用雌激素阻断剂ICI 182，780和MEK磷酸酶阻断剂PD98059，我们发现，Gen引起的ERK的早期激活以及子宫平滑肌瘤细胞增生均被抑制。利用免疫共沉淀方法，我们证实在子宫平滑肌瘤细胞中Gen能引起ERα和IGF-IR的早期结合，而在雌激素阻断剂ICI 182，780存在时，这种早期作用被抑制，从而证明Gen能引起的ERα和IGF-IR之间的早期相互作用是ERα依赖性的。结论：在低剂量Gen作用下，ERα参与了子宫平滑肌瘤细胞的上述早期改变，并且在子宫平滑肌瘤细胞中ERα比ERβ更易于被激活。提示子宫平滑肌瘤细胞中ERα和IGF-IR两条信号通路之间相互作用的早期机制可能有助于解释在低剂量Gen作用下子宫平滑肌瘤细胞比子宫平滑肌细胞更易增生的原因。