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细胞自噬(Autophagy)是机体的一种重要的保护机制。近些年来的研究发现,自噬可以帮助清除侵入到生物体细胞内的微生物和病毒,发挥免疫作用。生物可通过自噬直接降解感染宿主细胞内的细菌或病毒或阻止病毒DNA的复制,即通过自噬响应抵御细菌或病毒等微生物的入侵,而病原则可能发展出对抗甚至利用宿主自噬响应的应对机制,使之逃脱甚至利用细胞的自噬响应。目前的研究表明,哺乳动物和果蝇的病毒引发宿主的自噬响应参与机体或细胞的免疫作用,但其诱发的自噬信号通路和病原病毒抵抗自噬响应的机制均为个性特征,对其是否存在共性机制目前尚无定论。苜蓿丫纹夜蛾核型多角体病毒(Autographa californica nucleopolyhedrovirus,AcMNPV)是鳞翅目昆虫草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)的病原之一,目前尚无其感染宿主能否诱导自噬响应及其相应的机制的研究报道。本文以鳞翅目昆虫草地贪夜蛾Sf9细胞作为宿主细胞,以带有识别标记的GFP-AcMNPV和DsRed-AcMNPV二种重组病毒作为感染Sf9细胞的病毒,初步研究AcMNPV感染Sf9细胞是否诱发宿主的自噬响应和病毒是否受到宿主自噬响应抑制的影响?本文实验主要获得以下初步研究结果:1.通过测定二种重组病毒GFP-AcMNPV和DsRed-AcMNPV病毒的滴度,得出GFP-AcMNPV病毒滴度TCID50为1.26×106/mL,DsRed-AcMNPV病毒滴度TCID50为9.35×107/mL。两种病毒感染Sf9细胞后24h,荧光显微镜观察结果表明二种重组AcMNPV病毒都能够感染草地贪夜蛾Sf9宿主细胞,并能在细胞中增殖。2.在GFP-AcMNPV病毒感染Sf9细胞后12h、24h、36h和48h进行Lyso-Tracker Red染色镜检发现:在病毒感染后24h、36h、48h三个时间段,细胞发生自噬溶酶体的数目均显著增加。3.在DsRed-AcMNPV病毒-Sf9细胞自噬响应实验中:感染DsRed-AcMNPV病毒后48h(1)透射电镜观察到Sf9细胞内发生的自噬体双层膜泡结构;(2)成功转染重组质粒pIEX-4-EGFP-BmAtg8后,荧光显微镜观察发现Sf9细胞内聚集的绿色荧光斑点(EGFP-ATG8-PE)数目显著增加;(3)Western blotting检测证实:与对照相比,处理组的细胞中的EGFP-ATG8-PE蛋白质的表达水平上调。这些实验证据均表明AcMNPV感染Sf9细胞后引发宿主细胞的自噬响应。4.Western blotting检测感染紫外灭活的UV-DsRed-AcMNPV病毒的Sf9细胞中EGFP-ATG8-PE的表达,提示AcMNPV病毒衣壳蛋白是诱导Sf9宿主细胞自噬响应的原因之一。5.病毒滴度测定结果表明,DsRed-AcMNPV病毒能够在感染Sf9宿主的自噬响应中继续繁殖,氯喹阻断自噬小体向自噬溶酶体的融合后,病毒在宿主的繁殖被显著上调,这暗示了病毒存在抵抗Sf9宿主自噬抑制的机制。本研究结果表明,AcMNPV病毒感染Sf9细胞后,诱导宿主细胞自噬响应,病毒的衣壳蛋白可能参与了诱导宿主细胞的自噬响应,病毒能够抵抗宿主细胞的自噬抑制而继续繁殖。AcMNPV病毒抵抗或者利用Sf9宿主自噬响应的分子机制是今后需要深入研究的问题。