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天然橡胶是产胶植物的一种次生代谢产物,具有耐高温、高弹性等突出优点,是合成橡胶不可比拟的一种世界性工业原料和重要的战略物质,具有极高的经济价值及应用前景。天然橡胶的主要来源是巴西橡胶树(Heveabrasiliensis),而乳管是橡胶生物合成的主要场所。外施乙烯利可以延迟排胶时间,增加橡胶产量。因此人们认为,乙烯调控天然橡胶的生物合成。但是,乙烯对天然橡胶生物合成的关键酶基因的表达没有影响,表明天然橡胶的生物合成不受乙烯调节。我们己获得初步证据,割胶和外源茉莉酸均能上调天然橡胶生物合成关键酶基因的表达,推测橡胶的生物合成可能主要受茉莉酸信号途径调节。MYC家族的一些转录因子是茉莉酸信号途径的关键环节。因此研究橡胶树MYC基因功能对于揭示天然橡胶生物合成调控机制具有重要意义。
本文以巴西橡胶树无性系7-33-97的胶乳为研究材料,通过RT-PCR、RACE、Northern-blot及转基因等技术分离、鉴定了与茉莉酸信号途径相关的MYC基因。结果如下:
1.根据GenBank上的已知的一段MYC基因的EST序列,通过PCR和RACE技术,从橡胶树胶乳中克隆了编码MYC转录因子的cDNA,命名为HbMYC1。该基因序列的长度为1817bp,包含一个1428bp的阅读框,编码476个氨基酸。推导的HbMYC1分子量为53.78kD,等电点为6.20。该氨基酸序列与拟南芥(A.thaliana,gi|1465368)、菜豆(P.vulgaris,gi|1142621)、马铃薯(S.tuberosum,gi|45421750)和油菜(B.oleracea,gi|89274228)的MYC转录因子的同源性分别是70%、67%和56%和50%。
2.生物信息学分析表明,在HbMYC1序列中存在着一个特征性的DKASLLADAVTYIKEL(336-352)螺旋-环-螺旋(Helix-Loop-Helix)二聚体信号结构域,能够形成bHLH同源或异源二聚体蛋白。核定位信号预测软件表明该序列中存在一个RQRRER(311-316)的NLS(NuclearLocalizationsignal)序列。
3.Northem-blot分析表明,HbMYC1在胶乳表达量较高,在叶片和树皮中几乎不表达。该基因在正常割胶的胶乳中表达量非常高,在未开割的胶乳中表达量很低,但在不同部位胶乳间表达没有明显差异。
4.构建了巴西橡胶树HbMYC1基因的表达载体,并转化拟南芥。目前已经得到T0代种子,通过除草剂basta抗性筛选,已获得12株正向插入的HbMYC1转基因植株和10株反义插入的转基因植株。
上述结果表明,HbMYC1基因是.MYC基因家族成员,在乳管细胞中特异表达,且显著被割胶上调,表明它可能是与茉莉酸信号途径相关的MYC基因家族成员。这些研究结果为进一步研究茉莉酸信号途径及其对橡胶生物合成的调控机制打下了良好基础。