本论文对Enterobacter cloacae (E. cloacae)的内切葡聚糖酶ce18A和Bacillus licheniformis (B. licheniformis)的外切葡聚糖酶ce148B进行研究。首先,克隆表达E. cloacae的内切葡聚糖酶基因cel8A,研究其酶学性质,包括最适温度、最适pH、Km、Vmax值和比活力的测定。其次,对B.licheniformis的外切葡聚糖酶基因cel48B进行克隆表达,对该酶作定性研究,并对外切葡聚糖酶cel48B基因进行定点突变,获得突变酶E38Q、E49Q和D228N,将其酶活与原始酶活性进行比较,最后对这两个酶进行协同作用研究。从NCBI(美国国立生物技术信息中心)得到同源基因序列并设计引物,利用PCR技术从E. cloacae中扩增出大小为1.029kb的内切葡聚糖酶基因cel8A。构建的表达载体pQE30-cel8A并转入Escherichia coli XL1-blue(E. coli XL1-blue)中进行高效表达,重组子在羧甲基纤维素钠(CMC-Na)平板上有明显水解圈。通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测,在37kD处有明显表达条带,与预期结果相符。通过NTA-Ni亲和层析纯化后,对ce18A重组酶的酶学性质进行了测定,其最适温度为40℃,最适pH为7.0,Km值为46.95mg/mL, Vmax值为0.38μmol/min,比活力为3.56U/mg。同样方法,从NCBI获得同源基因序列并设计引物,利用PCR技术从B. licheniformis中扩增出一段大小为2.1kb的外切葡聚糖酶ce148B基因片段。构建表达载体pQE30-cel48B并转入E. coli XL1-blue中进行高效表达,通过SDS-PAGE检测,在77kD处有明显表达条带,与预期结果相符。通过NTA-Ni亲和层析纯化后,ce148B外切葡聚糖酶分别与底物纤维四糖和酸膨胀纤维素反应,经薄层层析(TLC)分析其主要产物为纤维二糖和葡萄糖,证明了外切葡聚糖酶ce148B有外切葡聚糖酶活性。并对外切葡聚糖酶基因cel48B进行了定点突变,确定了38、49、228为定点突变位点。利用反向PCR技术,获得三个突变酶E38Q、E49Q和D228N,将其酶活与原始酶进行比较,突变酶E38Q和D228N已经没有了外切葡聚糖酶活性,突变酶E49Q依然有外切葡聚糖酶活性。最后对内切葡聚糖酶ce18A和外切葡聚糖酶ce148B协同作用研究。就目前实验结果,两者的协同作用小于或等于两者分别作用的总和,因此不同来源的内切葡聚糖酶和外切葡聚糖酶协同作用有待进一步研究。