论文部分内容阅读
研究背景急性心肌梗死(acutemyocardial infarction,AMI)是指冠状动脉血流中断,受累区心肌细胞严重而持久缺血导致的一系列综合征。AMI发生后,如果心肌缺血持续存在,梗死区大部分心肌细胞将难免死亡的命运,有部分心肌细胞可在慢性持续缺血状态下,逐渐进入“冬眠状态”,形成冬眠心肌而维持自身存活。然而,近年来的研究表明,这部分冬眠心肌细胞的数量,恰恰与血运重建治疗后心脏的受益程度及预后密切相关。色素上皮细胞衍生因子(pigment epithelium-derived factor,PEDF)属于丝氨酸蛋白酶抑制剂超家族,具有抗血管生成、抗血管渗透、抗炎和营养神经细胞等多种生物学活性。我们在前期研究中发现,心脏缺血区早期,血浆及缺血区心肌的PEDF表达都显著下降;局部心肌转染PEDF后,可以显著减少缺血区心肌细胞的凋亡和程序性坏死,显著保护AMI模型大鼠的心脏功能。研究过程中我们进一步发现体外培养条件下的原代心肌细胞受PEDF蛋白干预后,缺氧时,存活的原代心肌细胞在形态及功能上有别于非干预细胞,进一步的机制研究背景下,我们提出假设:在急性缺血状态下,PEDF能够通过调节代谢和功能重塑,使心肌细胞处于类似于冬眠心肌的“冬眠状态”,从而有效保存了更多心肌细胞,为后续治疗提供了细胞学基础。PEDF是一种分泌性蛋白,须通过细胞膜受体介导才能发挥生物学作用。近年来的研究已经确认心肌细胞上存在一个80kDa的PEDF膜受体,称之为PEDF受体(PEDF receptor,PEDF-R)。PEDF-R具有磷脂酶A2和脂肪酶活性,PEDF与其结合后,能够激活上述两种酶活性而发挥脂解作用,生成的游离脂肪酸(free fatty acids,FFAs)、甘油二酯(diglyceride,DAG)和溶血磷脂酸(lysophosphatidic acid,LPA)作为第二信使发挥生物学作用。细胞内FFAs,LPA作为细胞内信号分子,在抗氧化、调节血糖及细胞保护等方面的作用已经被认识;DAG通过激活蛋白激酶C(protein kinase,PKC)在细胞内发挥广泛的作用。综上所述,我们推测:在急性心肌缺血发生时,PEDF通过激活PEDF-R酶活性,释放出FFAs、DAG、PLA,参与了心肌细胞代谢和功能重塑,促使其进入类似于冬眠心肌的“冬眠状态”,暂时性降低心肌细胞的能量消耗,最大限度的提供存活条件。这部分细胞将为心肌梗死后的再血管化提供细胞储备。第一部分预转染目的基因的非开胸大鼠急性心肌梗死模型的建立目的开胸结扎冠脉血管并局部注射转基因动物模型,由于存在基因表达延迟性,在研究急性心肌梗死的基因治疗时具有局限性,因此,设计了一个非二次开胸可实现结扎/松解冠脉血管的动物模型,目的基因病毒预注射,检测基因表达后,再实行非二次开胸的心肌缺血/再灌注损伤,本部分验证动物模型的可行性及有效性,为后续研究提供动物模型基础。方法选择SD大鼠,麻醉后经左侧第四肋间开胸。在冠状动脉左前降支预置结扎线和松解线,同时在其血供区(预测结扎后缺血区),心肌注射携带绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)基因的慢病毒。术后第1、3、5、7d检测转染区心肌GFP的蛋白表达,检测炎性因子肿瘤坏死因子-α(tumornecrosis factor,TNF-α)和白介素-1(interleukin-1,IL-1)的变化,检测血清中C反应蛋白(C reactive protein,CRP)、血管紧张素 Ⅱ(angiotensin Ⅱ,Ang Ⅱ)、抗利尿激素(antidiuretic hormone,ADH)的变化,并通过心脏超声检测动物心率(HR)、心输出量(CO)、射血分数(EF%)和左室短轴缩短率(FS%)。术后第7dGFP组和sham组都实施缺血/再灌注,Evan’s/TTC染色检测动物心肌梗死区面积比。结果预置线并转染携带GFP基因的慢病毒后,转染区GFP表达持续升高,5d后达到稳定状态。转染区TNF-α、IL-1及血清中CRP在术后1-3d逐渐升高,第7d恢复正常水平;血清中Ang II、ADH在术后1-3d逐渐升高,第Sd恢复正常水平。术后第Id HR升高,CO下降,至第5d恢复正常水平;EF%和FS%在术后第Id降低,至第7d恢复正常水平。术后第7d实施缺血再灌注后GFP组动物心肌梗死区与缺血危险区比率与sham组(也实施了I/R)相比,无统计学差异。第二部分PEDF诱导急性心肌梗死大鼠心肌细胞进入“冬眠状态”目的检测PEDF对发生AMI后心脏收缩功能以及心脏储备功能的影响,推断冬眠心肌的形成情况,探究PEDF是否可诱导急性缺血心肌细胞快速进入“冬眠状态”,方法前期动物模型下,冠状动脉左前降支预置结扎线,局部心肌内注射携带PEDF基因的慢病毒,7日后在非二次开胸状态下实施AMI,心脏彩超分别于AMI后第1、2、4、6、8周检测心脏功能,8周后进行多巴酚丁胺负荷试验,心脏彩超检测心脏储备功能。结果AMI后1～2周,PEDF组EF%、FS%降低(与GFP组相比,P<0.05);急性心肌梗死6-8周,PEDF组EF%、FS%升高(与GFP组相比,P<0.05)。急性心肌梗死8周后,多巴酚丁胺负荷试验示:PEDF组心脏储备功能(△EF%、AFS%)显著增高(与GFP组相比,P<0.05)。第三部分PEDF/PEDF-R诱导缺血心肌细胞进入“冬眠状态”的相关机制目的使用离体培养的H9c2细胞和大鼠乳鼠原代心肌细胞,在对细胞线粒体密度、自噬、Ca2+水平、收缩力等可能与PEDF诱导缺血心肌细胞进入“冬眠状态”有关的条件进行检测,并使用siRNA敲减PEDF-R来探讨相关机制,进一步验证PEDF是否能够诱导急性缺氧心肌细胞收缩力下调,其机制是否与PEDF激活心肌细胞膜上的PEDF-R有关。方法D-Hank’s液和缺氧培养模拟心肌缺血;在培养基中加入重组PEDF蛋白;siRNA敲减PEDF-R。Mito-Tracker(?)Red线粒体探针标记线粒体,使用荧光显微镜和流式细胞分析仪检测细胞线粒体密度;Western blot检测细胞中线粒体自噬相关蛋白Atg5表达;透射电镜观察细胞自噬小体的密度,气相色谱-质谱联用(GC-MS)分析检测细胞内游离FFAs水平;ELISA法检测细胞内DAG水平;Fura2-AM钙离子探针检测各组原代心肌细胞Ca2+水平;视频监测系统观察心肌细胞收缩变化。结果与缺氧对照组相比,加入PEDF后,缺氧条件下H9c2细胞的线粒体密度下降(P<0.05),细胞内自噬小体增多(P<0.05);加入PEDF后,在缺氧不同时间点(6h,12h,18h,24h)检测Atg5蛋白均高于单纯缺氧组(P<0.05);siRNA-PEDF-R可阻断发生(P<0.05)。H9c2细胞缺氧条件下,PEDF组棕榈酸(palmitic acid,PA)和DAG显著增多;siRNA-PEDF-R可阻断发生(P<0.05)。与正常培养的原代心肌细胞相比,缺氧对照组细胞内Ca2+水平升高(P<0.05),PEDF组细胞内Ca2+水平较缺氧对照组低(P<0.05),siRNA-PEDF-R可阻断发生(P<0.05)。缺氧条件下,各组心肌细胞收缩力都随时间延长而下降,与缺氧对照组比,PEDF组心肌细胞收缩力下降速度加快(P<0.05);siRNA-PEDF-R 可阻断发生(P<0.05)。结论:1.本研究AMI动物模型,实现了外源性目的基因充分表达后,非二次开胸实施AMI,提高了缺血心脏基因转染实验研究的科学性。2.PEDF-R介导PEDF增加缺氧心肌细胞脂质分解,经FFAs及DGA信号通路,增加缺氧心肌细胞线粒体自噬、减少肌浆网Ca2+释放,降低心肌收缩力及能量消耗,诱导缺血心肌细胞进入“冬眠状态”。