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黄颡鱼(Pelteobagrus fulvidraco)是我国重要的名优新淡水养殖品种。但近年来,随着养殖规模的扩大和养殖密度的提高,病害发生日趋严重,制约着黄颡鱼养殖业的健康发展。干扰素(interferon,IFN)反应是鱼类抵抗病原感染的第一道防线。干扰素调节因子(interferon regulatory factors,IRFs)调节干扰素及干扰素刺激效应基因的表达,在免疫反应中发挥重要作用。本研究克隆、鉴定了黄颡鱼IRF家族的13个基因。采用生物信息学方法分析了 IRFs基因的序列特征,通过荧光定量PCR检测了 IRF在正常黄颡鱼组织中的分布特点。分别用鲇爱德华氏菌(Edwardsiellaictaluri)、polyI:C和LPS诱导黄颡鱼,在诱导后不同时间段分析了脾和头肾中IRF表达量的变化。进一步针对IRF3、IRF7和IRF9开展了初步的功能研究:通过构建融合绿色荧光蛋白(GFP)或红色荧光蛋白(DsRed)的真核表达载体,研究了三者的亚细胞定位,以及IRF9和STAT1A、STAT1B、STAT2的定位关系。在过表达IRF3、IRF7和IRF9的细胞中,检测了 IFN基因的表达,分析了三者对IFN的诱导。取得的主要成果如下:(1)黄颡鱼IRF基因克隆和序列分析克隆了黄颡鱼 IRF 家族的 13 个成员(PfIRF1、PfIRF2A、PfIRF2B、PfIRF3、PfIRF4A、PfIRF4B、PfIRF4C、PfIRF5、PfIRF6、PfIRF7、PfIRF8、PfIRF9、PfIRF10)。序列分析显示,黄颡鱼IRF基因具有脊椎动物IRF家族保守的结构特征,包括N端的DNA结合结构域(DBD)和C端的IRF结合结构域(IAD)。此外,PfIRF3包含一个富含丝氨酸的C端结构域。三个PfIRF4基因都有两个核定位信号(NLS),但仅PfIRF4A包含丝氨酸结构域。PfIRF5具有两个核定位信号,但缺少病毒活化结构域(VID)。PfIRF7包括一个丝氨酸富集结构域。PfIRF8和PfIRF9有两个核定位信号,PfIRF9还包含一个脯氨酸结构域。进化树分析显示,黄颡鱼IRF基因归为脊椎动物IRF家族的四个亚家族。其中,PfIRF1、PfIRF2A、PfIRF2B 属于 IRF1 亚家族;PfIRF3、PfIRF7 属于 IRF3 亚家族;PfIRF4A、PfIRF4B、PfIRF4C、PfIRF8、PfIRF9、PfIRF10 属于 IRF4 亚家族;PfIRF5、PfIRF6属于IRF5亚家族。(2)黄颡鱼IRF基因的组织表达特征分析通过荧光定量PCR检测了 IRF在健康黄颡鱼组织中的表达水平。结果显示,IRF基因在所检测的八种组织(肝、脾、头肾、后肾、鳃、肠、皮肤、心)中遍在分布。PfIRF1在脾和后肾中高表达,在皮肤中表达量最低。PfIRF2A和PfIRF2B在肝中表达量最高,在其他组织中表达量低。PfIRF3在后肾中表达量最高,在肠中表达量最低。PfIRF4A、PfIRF4B、PfIRF4C在头肾、后肾、鳃和脾中表达量高,而在肠和肝中表达量低。PfIRF5在头肾、皮肤和心中高表达。PfIRF6在心和鳃中高表达,在皮肤中表达量最低。PfIRF7在肝中的表达量最高,而PfIRF8、PfIRF9和PfIRF10均在鳃中的表达量最高。(3)黄颡鱼IRF基因受诱导剂诱导的表达特征分析分别用polyI:C、LPS、鲇爱德华氏菌诱导黄颡鱼,在诱导后0h、3h、6h、12h、24 h、48h、72 h、96 h取头肾和脾,进行荧光定量PCR,检测IRF的表达量。结果显示,在三种诱导剂诱导后,IRF基因的表达出现不同程度的上调。在polyI:C诱导的头肾中,PfIRF1、PfIRF3、PfIRF4B、PfIRF4C、PfIRF6、PfIRF7 在诱导 3h 表达量达到最高峰;PfIRF8在诱导6 h表达量最高;PfIRF4A、PfIRF5、PfIRF10在诱导12 h表达量最高。PfIRF2A、PfIRF2B、PfIRF9在诱导24h表达量最高。在polyI:C诱导的脾中,PfIRF5在诱导3h表达量达到最高峰;PfIRF1、PfIRF2A、PfIRF6在诱导6h表达量最高;PfIRF9在诱导12 h表达量最高;PfIRF4B在诱导24h表达量最高;PfIRF2B、PfIRF3、PfIRF10 在诱导 48 h表达量最高;PfIRF4A、PfIRF4B、PfIRF7、PfIRF8 在诱导 72h 表达量最高。在 LPS 诱导的头肾中,PfIRF2B、PfIRF5、PfIRF7、PfIRF9、PfIRF10 在诱导 3h 表达量到达最高峰;PfIRF1、PfIRF4A、PfIRF8在诱导6h表达量最高;PfIRF2A、PfIRF3、PfIRF4B、PfIRF4C、PfIRF6在诱导12h表达量最高。在LPS诱导的脾中,PfIRF4A、PfIRF8 在诱导 6 h 表达量最高;PfIRF1、PfIRF2B、PfIRF3、PfIRF4B、PfIRF4C、PfIRF6、PfIRF7 在诱导 12h 表达量最高;PfIRF2A、PfIRF5、PfIRF9、PfIRF10 在诱导 24 h 表达量最高。在鲇爱德华氏菌诱导的头肾中,PfIRF6在诱导6 h表达量到达最高峰;PfIRF5在诱导12h表达量最高;PfIRF4B在诱导48h表达量最高;PfIRF1、PfIRF2A、PfIRF2B、PfIRF3、PfIRF4A、PfIRF4C、PfIRF6、PfIRF7、PfIRF9 在诱导 72 h 表达量最高;PfIRF10在诱导96h表达量最高。在鲇爱德华氏菌诱导的脾中,PfIRF4B在诱导6h表达量达到最高峰;PfIRF4A在诱导12 h表达量最高;PfIRF2B、PfIRF4C在诱导24 h表达量最高;PfIRF5 在诱导 48 h 表达量最高;PfIRF1、PfIRF2A、PfIRF3、PfIRF6 在诱导 72 h 表达量最高峰;PfIRF7、PfIRF8、PfIRF9、PfIRF10在诱导96h表达量最高。(4)黄颡鱼IRF3、IRF7和IRF9的亚细胞定位及对IFN的诱导分析构建了 pEGFP-PfIRF3、pEGFP-PfIRF7、pDsRed-PfIRF9 表达载体,转染 EPC 细胞。荧光显微镜观察结果显示,PfIRF3分布在细胞质中,PfIRF7分布于细胞质和细胞核中,PfIRF9定位于细胞核中。进一步分析了 PIRF9与信号转导及转录激活因子PfSTAT1和PfSTAT2的共定位情况。在单独转染上述基因的细胞中,PfSTAT1A聚集在细胞核周围,PfSTAT1B分布于细胞质和细胞核中,PfSTAT2定位于细胞质。当PfIRF9与PfSTAT1 A或PfSTAT1B共转染时,PfSTAT1A或PfSTAT1B的定位没有出现明显变化。而当PfIRF9与PfSTAT2共转染时,PfSTAT2出现了明显的核转位。在EPC细胞中过表达PfIRF3、PfIRF7和PfIRF9,通过荧光定量PCR检测细胞IFN基因的表达水平。结果显示,这三个IRF基因能明显诱导细胞中IFN表达。