奶牛乳房炎泛指能引起奶牛乳腺的各种疾病,不仅是奶牛最为常见的疾病之一,也是给养殖业带来巨大损失的一种疾病。奶牛乳房炎分布广泛,病因复杂,其病因、病情严重程度以及结果都与周围环境、病原菌和宿主本身有关,但病原微生物是引发该疾病的主要原因。肠球菌是存在于人和动物肠道中的正常菌群,常在所分离的能引起腹腔及盆腔感染的混合菌中发现,一般认为是对人畜不致病的共栖菌,但近几年的研究已证实肠球菌也拥有致病力。肠球菌能引起尿路感染以及皮肤感染,严重时甚至还能引发危及性命的疾病,例如腹腔感染、心内膜炎、败血病、脑膜炎等。而肠球菌性乳房炎主要是由肠球菌为主的多种病原菌混合而引起的感染,肠球菌只占引起奶牛乳房炎病原菌的一小部分,是其中的一种菌。尽管肠球菌性乳房炎的危害不及由主要病原菌引起的奶牛乳房炎,但是其能引起的牛奶质量下降和对奶牛乳腺造成损伤,使肠球菌性乳房炎不仅给养殖业造成严重的经济损失,同时也带来公共卫生安全和人类健康等诸多问题。因此,本研究以研究与研发新型奶牛乳房炎基因工程疫苗为目标,基于本实验室分离并鉴定的肠球菌为基础,运用分子生物学、基因工程和DNA重组技术等理论和方法,开展抗肠球菌性奶牛乳房炎基因工程疫苗的相关研究。首先,本研究采用美国临床检验标准委员会(NCCLS)推荐的微量肉汤稀释法,以本实验室分离、鉴定并保存的50株肠球菌为研究对象,检测其对临床常用的11种抗生素的敏感性,以期为该病的预防和临床选药提供依据。其次,本研究以本实验室分离并鉴定的肠球菌为基础,甄选出肠球菌表面蛋白(esp),采用PCR方法获得目的基因,利用T/A克隆将esp基因转入到[email protected],用限制性内切酶EcoRI和KpnI双酶切真核载体pcDNA3.1-HisB和含有esp基因的[email protected] Vector,分别得到线型pcDNA3.1-HisB基因和esp基因,并且其都具有EcoRI和KpnI限制性酶酶切末端。用T4连接酶连接两个线型基因,重新构建了真核载体pcDNA3.1 HisB-rib esp,转化入感受态细胞,筛选阳性克隆。最后,通过脂质体将目的基因转化入MCF-7真核细胞内,G418筛选后,得到稳定转染细胞系。用PCR、Western blot等方法检测,在约46kDa处有一新生蛋白条带,与理论蛋白分子量一致,所构建的真核重组表达质粒能在真核细胞中正确表达目的蛋白,结果显示真核重组质粒pcDNA3.1 HisB-rib esp构建成功。本研究将为肠球菌性奶牛乳房炎新型基因工程疫苗的研究提供了新的突破性思路,积累实验数据,建立技术平台,本实验结果也有望为肠球菌新型疫苗的动物保护实验和临床前研究奠定基础,为采取科学、合理的综合防治措施,从根本上控制奶牛乳房炎的发生和流行提供科学依据,开辟新的途径。