【摘 要】
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Butelase-1是来源于蝶豆的一种天冬酰胺内肽酶类多肽连接酶,具有识别序列简单、催化效率高等优点,已被应用于多肽或蛋白质的环化或连接以及细菌的标记等多个方面。为了提高大肠杆菌重组表达Butelase-1的活性和生物量,本文运用多种生物技术手段改造表达质粒并筛选表达菌株,显著提高了重组Butelase-1酶原激活后的酶活;并将Butelase-1应用于食源性抗癌多肽Lunasin的首尾“无痕”环
【基金项目】
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国家自然科学基金项目（32072157）； 广州市民生科技攻关计划项目（201803010080）；
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Butelase-1是来源于蝶豆的一种天冬酰胺内肽酶类多肽连接酶,具有识别序列简单、催化效率高等优点,已被应用于多肽或蛋白质的环化或连接以及细菌的标记等多个方面。为了提高大肠杆菌重组表达Butelase-1的活性和生物量,本文运用多种生物技术手段改造表达质粒并筛选表达菌株,显著提高了重组Butelase-1酶原激活后的酶活;并将Butelase-1应用于食源性抗癌多肽Lunasin的首尾“无痕”环化,探讨了Lunasin环化后抗癌活性与稳定性的变化规律。主要研究内容和结果如下:（1）通过筛选合适的宿主菌株、共表达分子伴侣、优化重组表达条件提高活性Butelase-1得率。在实验室前期构建的Butelase-1重组表达载体基础上,优化了宿主菌株,当把宿主菌株E.coli Rosetta gami B（DE3）更换为E.coli SHuffle T7时,Butelase-1的活性会显著提高;进一步优化重组蛋白的诱导表达条件,酶活得率可达1796.45 U/L发酵液。同时,将四种分子伴侣表达载体与Butelase-1重组质粒在大肠杆菌中共表达,发现Dsb C蛋白能使Butelase-1酶活得率显著提高。（2）同义稀有密码子替换提高Butelase-1酶活得率。针对Butelase-1酶原重组蛋白折叠不充分是制约Butelase-1酶活得率的可能原因,选择位于Butelae-1立体结构α-螺旋和β-折叠上的85、158、187、237及385位缬氨酸,将一个或多个大肠杆菌表达系统的偏爱密码子（GUG）同义突变为稀有密码子（GUA）,提高酶原的正确折叠比率,将Val85、Val158、Val187、Val237位组合SRC替换后,Butelase-1的酶活得率最高,为5059.32 U/L发酵液。（3）优化RBS和AS调控Butelase-1酶原表达。设计了9种不同强度的RBS并构建相应的表达载体,结果表明由RBS7调控的Butelase-1活性最高;进一步设计5种不同长度的AS并构建相应的表达菌株,结果表明,新设计的5种AS均不同程度地引起Butelase-1的酶活和产量下降。通过菌株和质粒的系列优化后,重组酶原的产量和激活后活性Butelase-1的产量分别为195.20 mg/L发酵液和19.25 mg/L发酵液,Butelase-1酶活为8183.54 U/L发酵液,比酶活为386.93 U/mg。（4）经测定,重组的Butelase-1酶反应动力学参数与天然Butelase-1酶动力学参数基本一致,其米氏常数、转换数和催化效率指数分别为Km=229.89μmol/L、kcat=2.53 s-1,kcat/Km=11048 M-1 s-1。利用该重组Butelase-1成功地将食源性抗癌多肽Lunasin首尾“无痕”环化,产率为91.7%。分离纯化环肽后测定其抗癌活性,发现Lunasin在环化之后活性提高约40%,稳定性提高约60%。
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