研究背景和目的瘢痕疙瘩是遗传易感性患者皮肤损伤后组织异常修复的结果,仅见于人类,亚洲人群多发,无合适动物模型。对各种治疗抵抗,复发率高,是目前皮肤科和整形美容外科的治疗难点之一。瘢痕疙瘩手术切除后早期结合电离辐射较其它治疗方案更为有效,且复发率和电离辐射总剂量显著相关。瘢痕疙瘩组织内最主要的功能细胞-成纤维细胞的异常增殖、分泌过多细胞外基质的特征性生物学行为,是瘢痕疙瘩形成过程中的重要因素,存在与肿瘤细胞相似的表观遗传学改变。本文拟通过瘢痕疙瘩与正常人皮肤及培养的原代成纤维细胞比较,阐明瘢痕疙瘩的发生发展过程中,是否存在多个基因及其相关途径的相互作用?部分基因是否存在表观遗传学相关改变,影响其表达,继而出现增殖、细胞周期、细胞代谢功能改变?不同剂量电离辐射是否部分针对这些环节,逆转相应基因表达,在电离辐射后不同阶段诱导瘢痕疙瘩成纤维细胞出现凋亡、衰老或其他表现型,继而产生治疗作用。本研究在表观遗传学领域,探讨不同剂量和时间电离辐射治疗瘢痕疙瘩的相关机制,为瘢痕疙瘩诊疗提供新的思路、治疗靶点和潜在治疗方案。研究方法和材料1、不同临床分期瘢痕疙瘩患者入组,签署知情同意书,判断瘢痕疙瘩严重程度,作分类积分及所处阶段评价,建立瘢痕疙瘩患者和相匹配正常人皮肤的原代成纤维细胞株,并经成纤维细胞鉴定,MTT/CCK8比色法绘制生长曲线,分析其增殖,流式细胞仪检测细胞周期,通过测定两种原代成纤维细胞培养基上清液中羟脯氨酸含量明确胶原产生区别。2、瘢痕疙瘩及其成纤维细胞p16基因启动子区功能失常的表观遗传学研究,分析其与瘢痕疙瘩严重程度及临床分期的相关性。取瘢痕疙瘩皮损及培养的原代成纤维细胞行亚硫酸氢盐修饰后测序(BSP法),检测p16基因甲基化状态。实时荧光定量PCR判断两种原代成纤维细胞DNA甲基转移酶(DNMTs)、p16、p21、p27基因表达区别。并用免疫组化方法检测皮损组织中p16、p21、p27、p53等细胞周期激酶抑制剂表达情况。比较瘢痕疙瘩皮损组织和正常皮肤及成纤维细胞源性肿瘤-纤维肉瘤的病理区别,通过增殖细胞核抗原Ki-67免疫组化染色检测瘢痕疙瘩和纤维肉瘤的增殖差异。3、电离辐射诱导瘢痕疙瘩成纤维细胞过早衰老及其相关基因表达改变：通过不同剂量(0、2、4、6、8Gy)、电离辐射后不同时间(3、6、12、24、48、72、96h)的作用,采用MTT/CCK-8比色法、台盼蓝染色分析、流式细胞仪检测辐照前后细胞形态、细胞周期分布、细胞增殖和存活能力变化；实时荧光定量PCR检测p16、p21、p27、DNMTs、I型前胶原mRNA变化；Westernblot法检测这些基因蛋白质水平改变,通过测定培养基上清液中羟脯氨酸含量明确电离辐射前后胶原总体水平变化；同时应用β-半乳糖苷酶染色检测贴壁瘢痕疙瘩成纤维细胞衰老。根据增殖抑制情况,p16、p21、p27和I型前胶原基因表达,及与细胞周期分布的相关性,判断抑制效应最为显著的电离辐射剂量和时间。研究结果1、瘢痕疙瘩患者入组12例,患者组和对照组在性别及年龄构成比上无显著性差异。原代培养瘢痕疙瘩成纤维细胞(KFb)8例,正常人皮肤原代成纤维细胞(NFb)6例；在细胞学水平,KFb细胞虽然形态和NFb细胞相似,但KFb细胞增殖与胶原产生能力明显高于NFb细胞,与NFb相比,KFb处于G2/M期的比例显著增高,而G0/G1期比例则明显低于NFb。2、瘢痕疙瘩皮损及其成纤维细胞中p16基因启动子区存在甲基化状态,与正常皮肤细胞及肿瘤细胞均存在差异。KFb细胞中三种DNMTs基因和NFb细胞相比均存在高表达,细胞和组织中细胞周期相关基因p27低表达,组织中P53蛋白高表达。瘢痕疙瘩皮损真皮处部分Ki-67表达阳性率高于正常皮肤,远低于成纤维细胞源性肿瘤-纤维肉瘤,且不具备其异型性,胶原含量、核浆比、核分裂像等都有差异。3、电离辐射抑制两种成纤维细胞增殖,存在剂量和时间依赖模式,与NFb细胞相比,KFb细胞增殖抑制率更高。辐照后KFb细胞G0/G1期比例逐渐增高,出现G1期阻滞。4Gy电离辐射后72小时,衰老特异的B-半乳糖苷酶阳性,瘢痕疙瘩成纤维细胞呈衰老表现型,随时间延长,衰老细胞阳性比例增多。KFb细胞胶原产生能力降低。细胞周期相关基因p16、p21、p27mRNA和蛋白水平明显升高,分别在24小时和48小时表达出现高峰。辐照后KFb细胞DNMTs基因表达降低。结论瘢痕疙瘩中存在DNA甲基化状态改变,通过调控细胞周期相关基因转录表达,影响成纤维细胞增殖和胶原合成。研究提示瘢痕疙瘩中存在多个基因的相互作用,并在不同层次,不同阶段影响瘢痕疙瘩的发生发展。电离辐射抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖,阻滞细胞周期进程,诱导细胞过早衰老可能是电离辐射抑制瘢痕疙瘩复发的效应机制。瘢痕疙瘩发生发展的过程,介于正常细胞和肿瘤细胞之间,研究瘢痕疙瘩成纤维细胞在各种微环境下的表观遗传学改变,有利于加深对瘢痕疙瘩和肿瘤发生发展的认识,并为最终治愈这类疾病提供帮助。