外泌体作为一类活细胞分泌的粒径在30-150nm的小囊泡,包含有诸多母体细胞携带的生物信息。越来越多的研究表明外泌体的产生与传递与许多疾病的生理进程密切相关,是探索疾病机理、发掘生物标志物的重要来源。关于外泌体的研究主要有以下几个方面:第一,外泌体分离分析方法;第二,外泌体基因组学研究;第三,外泌体蛋白质组学研究。随着蛋白质组学时代的到来,关于外泌体蛋白质组学的研究得到了长足的发展。针对疾病细胞分泌的外泌体进行蛋白质状态、翻译后修饰动态监测,生物信息挖掘有助于发现新的生物标志物和潜在的药物靶标。一方面,生物信息的发掘可以使人们进一步的了解疾病的发生发展;另一方面,对疾病机理的深入探索可以为新药的研发提供专业可靠的信息。但是由于外泌体粒径小、生物样本提取量低、功能蛋白质含量少、质谱分析时糖基化修饰肽段离子化效率低等问题,通过质谱(MS)鉴定外泌体中的糖蛋白仍然是一项艰巨的任务。因此发展便捷、高效的外泌体蛋白/肽段的分离富集方法对于外泌体蛋白组学的发展具有重大意义。针对外泌体中糖基化蛋白丰度低以及质谱分析时离子化效率低等问题,我们制备出一种亲水磁性二维二硫化钼纳米复合材料(Mo S2-Fe3O4-Au/NWs-GSH),即通过将超薄二维二硫化钼(Mo S2)与磁性四氧化三铁(Fe3O4)纳米颗粒、纳米金线(Au/NWs)和谷胱甘肽(GSH)串联并功能化,制备了一种新型功能化磁性纳米亲水材料,并用于有效富集生物样本的N-糖肽。该材料的优点:第一,磁性Fe3O4纳米颗粒赋予纳米材料高灵敏的磁响应特性,更易于富集过程的分离洗脱,极大地简化了富集过程;第二,超细纳米金线的修饰进一步扩大了纳米复合材料的比表面积,其易于与巯基反应的特性为亲水基团提供了大量的反应活性位点;第三,高亲水性谷胱甘肽可以使N-糖肽特异性保留,提高了材料亲水性和富集容量。使用Mo S2-Fe3O4-Au/NWs-GSH富集标准蛋白胰蛋白酶酶切产物(Ig G,BSA)和生物质谱分析可以实现飞摩尔级别的检测灵敏度和1:1000的富集选择性。将其用于人尿液外泌体N-糖蛋白质组学研究,共鉴定出1250个N-糖基化肽段归属于613个糖蛋白。进一步将功能化材料用于人血清糖蛋白质组研究中,共鉴定出489个N-糖肽归属于258个糖蛋白。这一庞大的N-糖蛋白质组数据集表明Mo S2-Fe3O4-Au/NWs-GSH功能纳米复合材料在糖基化蛋白富集分离方面的巨大优势,能够有效解决外泌体或其它复杂生物样本在质谱分析时糖蛋白丰度较低的问题。另外,还基于硼酸化学法原理,制备了表面修饰4-巯基苯硼酸的功能化纳米复合材料(Mo S2/Au/4-MPB)。在本研究中,通过将纳米金线(Au)、4-巯基苯硼酸(4-MPB)与超薄二维二硫化钼(2D-Mo S2)进行简单便捷的两步反应,成功制备了一种用于富集蛋白质N-糖基化肽段的功能纳米材料(Mo S2/Au/4-MPB)。由于层状纳米结构的二硫化钼具有较小的分子间阻力,因此能有效地减少功能材料的非特异性吸附以及在富集洗脱过程中的传质阻力,且4-巯基苯基硼酸中硼酸基团可以对对N-糖肽进行无差别的选择,提高了生物样品中N-糖基化肽段的富集能力。使用标准蛋白人免疫球蛋白G和牛血清白蛋白胰蛋白酶酶切产物对新型功能纳米材料的N-糖基化肽段的富集性能进行评估,检测灵敏度达到5 fmol,选择性达到1:1000。将其用于生物样品中N-糖基化肽段的富集,从50μg尿液外泌体蛋白胰蛋白酶酶切产物中共富集鉴定出768个N-糖肽归属于377个蛋白。这些结果表明该新型功能纳米材料对复杂生物样品中N-糖肽的选择富集的应用有着巨大潜力,为复杂生物样本中的N-糖蛋白质组学的研究提供了一种新的方法。