论文部分内容阅读
目的:在过去的二十年间,间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs）的免疫抑制功能受到了广大学者的广泛关注。其中,人脐带源间充质干细胞（human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells,hUC-MSCs）以其来源丰富和无创性,成为分离获得间充质干细胞的重要来源。大量的研究报道显示间充质干细胞能够通过细胞接触和分泌可溶性调节物质两个途径对B淋巴细胞、T淋巴细胞、NK细胞以及DC进行免疫性调节。然而关于间充质干细胞对具体的疾病尤其是食物过敏（food allergy,FA）的影响尚不清楚。本文利用小鼠OVA实验性食物过敏模型研究了人脐带间充质干细胞对食物过敏小鼠临床症状、肠道免疫功能及菌群的影响,从而探讨间充质干细胞对食物过敏疾病的潜在治疗性应用。方法:1.人脐带间充质干细胞的制备与鉴定（1）将脐带组织洗尽剃去血管,剪成细碎的组织块,按照一定密度接种于细胞培养皿,放置37℃、含5%CO2饱和湿度培养箱内培养。隔三天观察并换液。当细胞生长达到约80%融合时,用含胰蛋白酶和EDTA的消化液消化并继续传代。（2）取第二代脐带源间充质干细胞,采用表面抗体染色分析其细胞表面CD73、CD90、CD105、CD34、CD45、CD14和HLA-DR抗原的表达。（3）将脐带源间充质干细胞按5×104个/cm2接种于六孔板中。待细胞长至80%融合时,分别换为成骨分化诱导液和成脂肪分化诱导液。隔天换液,成骨诱导至28天和成脂肪诱导第14天时分别进行茜素红染色和油红O染色鉴定。2.间充质干细胞对实验性食物过敏临床症状的影响（1）将20只健康BALB/c实验鼠随机分为四组:PBS组、FA组、FA+DMEM/F12组和FA+MSC组。分别进行食物过敏诱导和相对应的处理,记录过程中小鼠腹泻情况和体重变化情况。（2）食物过敏诱导和处理结束后,取出小鼠结肠组织观察内容物性状并拍照。3.间充质干细胞对小鼠肠道免疫功能的影响（1）收集小鼠血清,采用ELISA的方法检测血清总IgE的含量。（2）流式细胞术分析小鼠外周血以及肠系膜淋巴结中TH2细胞的比例。（3）荧光定量PCR法检测结肠固有层IL-4和TNF-α分子水平的表达。（4）结肠组织切片进行HE染色和PAS染色观察肠绒毛和杯状细胞变化。4.间充质干细胞对肠道菌群的影响（1）食物过敏诱导及相应治疗处理结束后,收集小鼠结肠内容物,利用高通量Miseq测序技术以及相关分析方法,定量分析肠道内微生物结构特征,包括OUT聚类分析、α和β多样性分析。（2）将分析结果以门水平和属水平分布作相对分度柱形图。结果:（1）脐带组织块在培养12天左右,周围出现梭形细胞生长。流式分析结果显示细胞表面高表达CD73、CD90和CD105分子,但CD34、CD45、CD14和HLA-DR抗原呈阴性。体外诱导成骨、成脂肪培养后,细胞茜素红染色有明显钙沉积物被染为红色;油红O染色发现细胞内脂滴被染为橘色或红色。（2）统计各组小鼠食物过敏期间体重变化无明显的差异。但是,分析各组小鼠腹泻的发生比例,发现间充质干细胞处理组小鼠腹泻发生较晚,腹泻比例下降。同时,食物过敏组与培养基对照组小鼠结肠内容物不成形,而间充质干细胞处理组则相对较成形。（3）食物过敏后,小鼠血清总IgE水平明显增加,而间充质干细胞处理后则发生显著的下降;同时外周血与肠系膜淋巴结中TH2细胞的分化受到压制。荧光定量PCR结果显示,治疗组的IL-4和TNF-α在结肠固有层的表达水平下降。结肠组织切片显示治疗组的肠绒毛水肿和炎症细胞浸润减轻,同时杯状细胞的增生减低。（4）菌群分析结果表明,间充质干细胞处理组小鼠肠道菌群稳态较实验组和培养基对照组有一定的恢复,其中,拟杆菌门明显增多,变形菌门显著下降。结论:间充质干细胞的应用改善了食物过敏小鼠的临床症状,其免疫抑制功能一定程度上抑制了小鼠体内过敏反应的发生,并且对小鼠肠道菌群有较好的恢复效应。