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大豆(Glycine max)是世界最重要的经济作物之一,为人类提供了优质的蛋白、植物油和次生代谢产物如异黄酮等。而大豆生长和品质形成受转录因子的调控。bHLH转录因子是最大的转录因子家族之一,在植物逆境响应、生长发育、次生代谢产物合成和激素信号传导等方面挥着重要作用。然而,大豆bHLH转录因子的功能研究较少。本研究筛选到2个与大豆品种吉林32籽粒发育协同表达基因,并通过系统进化树分析,确定这两个转录因子分别与拟南芥中AtbHLH3和At PIF1同源,命名为GmbHLH3和Gm PIF1。AtbHLH3和At PIF1分别被证实参与了JA信号应答和光应答途径,且均参与了苯丙氨酸代谢途径。但在大豆中,GmbHLH3和Gm PIF1功能尚未明晰。因此,本实验探究GmbHLH3和Gm PIF1转录因子对黄酮类化合物合成的调控作用以及分别在JA途径中的调控作用和光应答过程的影响。主要结果如下:1.从大豆品种吉林32中克隆得到GmbHLH3基因,CDS全长1521 bp。蛋白序列分析发现,其含有MYC结构域、bHLH结构域和核定位信号。进化树分析证实,GmbHLH3与拟南芥中的AtbHLH3、AtbHLH13和AtbHLH17的亲缘关系较近。亚细胞定位实验表明,GmbHLH3定位于细胞核。实时荧光定量PCR(q RT-PCR)结果显示,GmbHLH3在大豆品种吉林32中的所有组织中均有表达,其中在花中的表达水平最高,在未成熟胚中的表达水平随胚的发育而升高。2.利用大豆发根系统,分析过表达及干扰GmbHLH3和Gm PIF1基因对大豆发根异黄酮积累的影响。结果表明,与非转基因发根相比,过表达GmbHLH3和Gm PIF1基因均可显著提高异黄酮总量;干扰GmbHLH3和Gm PIF1基因均可显著降低异黄酮的积累。其中,过表达GmbHLH3,显著提高了大豆黄素的含量。尽管过表达Gm PIF1基因显著提高了异黄酮的总量,但转化发根的异黄酮各组分含量与对照间无显著差异。利用q RT-PCR分析GmbHLH3和Gm PIF1转化发根中黄酮类物质合成相关基因的表达,结果表明,过表达GmbHLH3株系中,Gm PAL1、Gm4CL、Gm C4H、Gm CHI1B1、Gm IFS2和Gm F3H基因的转录水平升高,Gm CHI1A基因的转录水平下降。过表达Gm PIF1转化根系中,Gm PAL1、Gm CHI1B1和Gm IFS2基因的转录水平升高。进一步将GmbHLH3和Gm PIF1过表达于拟南芥,利用高效液相色谱法(HPLC)测定转化株系种子中的黄酮含量。结果表明,过表达GmbHLH3和Gm PIF1的拟南芥株系种子的黄酮总量显著高于对照。综合转化发根及拟南芥的结果,推断过表达GmbHLH3和Gm PIF1转录因子能促进拟南芥种子中黄酮类物质的积累。3.利用q RT-PCR分析GmbHLH3转录因子在ABA、Na Cl、ET、高温、低温、SA、PEG和Me JA逆境处理条件下的转录模式,结果表明,GmbHLH3对不同处理的响应不同,其中在Me JA处理的24 h内,GmbHLH3的转录水平均显著高于对照,且在处理3 h时具有转录峰值。4.利用酵母双杂交技术,证实GmbHLH3转录因子在酵母中没有转录自激活活性,且GmbHLH3蛋白与其同源蛋白AtbHLH3、AtbHLLH13和GmbHLH3a共转入酵母后能在SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/3-AT四缺筛选培养基上生长;利用双分子荧光互补实验分析,GmbHLH3蛋白与AtbHLH3、AtbHLLH13和GmbHLH3a蛋白共转入烟草瞬时表达后能观察到YFP荧光信号。这些结果表明,GmbHLH3蛋白能与AtbHLH3、AtbHLLH13和GmbHLH3a互作。5.将GmbHLH3在拟南芥中过表达,在5μM和25μM Me JA处理条件下,过表达GmbHLH3拟南芥的根长均显著长与野生型。在25μM Me JA处理条件下,过表达GmbHLH3拟南芥中,病原体应答基因At PDF1.2、创伤应答基因At VSP1、At LOX2和At TAT1的表达水平降低。6.利用Me JA处理5周龄的拟南芥离体叶片时发现,与对照相比过表达GmbHLH3减缓了叶片衰老,且衰老促进基因At SAG29、At AZF2和At WRKY22和叶绿素代谢相关基因At SGR、At NYC1、At CLH1、At PPH和At PAO的转录水平降低,衰老抑制因子At MKP2的转录水平升高。7.分析黑暗下处理5 d和7 d后过表达Gm PIF1株系的表型,发现过表达Gm PIF1株系的下胚轴比野生型显著增长,子叶展开角度显著减小,且在黑暗5d时,过表达Gm PIF1株系的顶端弯钩角度显著大于野生型。检测暗处理2-7 d的拟南芥中的原叶绿素酸酯(Pchlide),发现Pchlide随着培养时间的增加而增加,过表达Gm PIF1株系的Pchlide含量高于野生型。利用q RT-PCR分析5 d黄化苗叶绿素合成基因的表达,结果表明,过表达Gm PIF1株系中叶绿素合成基因和光合作用基因At HEMA1、At GUN5、At LHCB6和At PSAE1转录水平降低,而Pchlide代谢基因At PORC转录升高。8.将1-7 d黄化苗转入白光3 d后调查绿化率,结果表明,黑暗培养4 d以上后,过表达Gm PIF1株系的绿化率要高于野生型。4-7 d的黄化苗见光后植株中的叶绿素含量随着暗培养时间的增加而减少,且过表达Gm PIF1株系的叶绿素含量均显著高于野生型。利用q RT-PCR分析5 d黄化苗见光1 h时,过表达Gm PIF1株系中叶绿素合成基因和光合作用基因At HEMA1、At GUN5、At LHCB6和At PSAE1转录水平比野生型升高。9.利用酵母双杂交系统,分析Gm PIF1蛋白短截体与Gm PHYA和Gm PHYB短截体的互作。结果表明,Gm PIF1蛋白序列全长能与Gm PHYA和Gm PHYB短截体互作,但Gm PIF1的短截体不再能与Gm PHYA和Gm PHYB互作。综上,大豆GmbHLH3和Gm PIF1基因分别与大豆JA响应及形态建成中起作用,且均参与黄酮类物质的积累。研究结果可丰富人们对大豆bHLH转录因子的认知,也可为大豆分子育种提供基因资源。