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目的：原核表达金黄色葡萄球菌agrA蛋白，并研究agrA蛋白对肺癌A549细胞β-防御素的表达影响以及调控作用机制。
方法：提取金黄色葡萄球菌菌体的总RNA，将菌体的总RNA反转录为cDNA；利用高保真DNA聚合酶进行PCR反应扩增目的基因，琼脂糖凝胶电泳后，切下凝胶块回收DNA；将回收到的目的基因与质粒pEASY-Blunt E1 Expression Vector连接后，将连接好的质粒转染到Trans1-T1感受态细胞中，提取菌体质粒并测序鉴定，测序正确说明已经成功构建正确的质粒；将连接正确的质粒转化入BL21大肠杆菌中构建蛋白表达载体，异丙基-β-D硫代半乳糖苷（Isopropyl dithiophosphate beta-D galactose，IPTG）诱导表达载体表达蛋白后提取菌体总蛋白，利用SDS-PAGE进行蛋白表达检测；检测正确后，再大量诱导载体表达蛋白，将表达出的蛋白进行纯化；用纯化好的agrA作用于生长状态良好的A549细胞，按照作用时间分为0h、3h、6h、12h四组，每组加入等量等浓度的agrA蛋白；提取各组的A549细胞的总蛋白后，用western blotting法检测不同作用时间组的A549细胞β-防御素（1，2，3）的表达量，以及MAKP通路上的关键蛋白ERK1/2、P38和JNK的表达量及其三种蛋白的磷酸化程度。
结果：
（1）提取到的金葡菌总RNA反转录得到cDNA，经高保真DNA聚合酶PCR，2%琼脂糖凝胶电泳结果可见扩增出约717bp的条带，与agrA的分子大小相当。琼脂糖凝胶DNA回收后，再用琼脂糖凝胶电泳验证，电泳结果中与目的基因大小相符，说明已经得到了agrAcDNA。
（2）agrA cDNA与pEASY-Blunt E1 Expression Vector质粒连接后转化至Trans1-T1感受态细胞中培养，取菌体用T7 Promoter Primer和agrA的反向引物进行PCR，琼脂糖凝胶电泳结果有与目的基因agrA大小相当的条带，提示目的基因agrA已经插入质粒载体中。
（3）重组质粒送至生物公司测序，测序结果与GeneBank公布的agrA基因碱基序列一致，因此，重组质粒pEASY/agrA已经构建成功。
（4）重组质粒pEASY/agrA转入BL21大肠杆菌中构建表达载体，诱导表达蛋白后，SDS-PAGE电泳发现，未用IPTG的阴性对照组没有产生agrA蛋白，而用IPTG诱导实验组表达出相对分子量为26kd的蛋白，这与目的蛋白agrA大小相符，说明表达载体构建成功。
（5）大量诱导表达的菌体裂解后，SDS-PAGE电泳发现agrA蛋白主要在上清表达，取菌体裂解到的上清液纯化，SDS-PAGE电泳图中，在26kd处有条带，这与目的蛋白大小一致。
（6）agrA作用于A549细胞后，western blotting法检测四组不同作用时间的β-防御素（1，2，3）的表达量，发现随着agrA蛋白作用于A549细胞时间的延长，β-防御素（1，2）的表达量基本恒定，而β-防御素3的表达量却显著增强；
（7）western blotting法检测四组不同作用时间MAKP通路上的关键蛋白ERK1/2、P38和JNK的表达量，随着作用时间的延长p-JNK/JNK、P38/p-P38的表达量基本无差异，p-ERK1/2/ERK1/2的表达显著增加。
结论：
（1）成功构建了含有agrA目的基因的重组质粒pEASY/agrA，并利用原核表达载体诱导表达并纯化了agrA蛋白。
（2）金黄色葡萄球菌agrA能够使A549细胞的β-防御素3表达量增加。
（3）金黄色葡萄球菌agrA可能是通过 MAPK信号通路中ERK1/2的磷酸化来调控诱导β-防御素3的表达。
方法：提取金黄色葡萄球菌菌体的总RNA，将菌体的总RNA反转录为cDNA；利用高保真DNA聚合酶进行PCR反应扩增目的基因，琼脂糖凝胶电泳后，切下凝胶块回收DNA；将回收到的目的基因与质粒pEASY-Blunt E1 Expression Vector连接后，将连接好的质粒转染到Trans1-T1感受态细胞中，提取菌体质粒并测序鉴定，测序正确说明已经成功构建正确的质粒；将连接正确的质粒转化入BL21大肠杆菌中构建蛋白表达载体，异丙基-β-D硫代半乳糖苷（Isopropyl dithiophosphate beta-D galactose，IPTG）诱导表达载体表达蛋白后提取菌体总蛋白，利用SDS-PAGE进行蛋白表达检测；检测正确后，再大量诱导载体表达蛋白，将表达出的蛋白进行纯化；用纯化好的agrA作用于生长状态良好的A549细胞，按照作用时间分为0h、3h、6h、12h四组，每组加入等量等浓度的agrA蛋白；提取各组的A549细胞的总蛋白后，用western blotting法检测不同作用时间组的A549细胞β-防御素（1，2，3）的表达量，以及MAKP通路上的关键蛋白ERK1/2、P38和JNK的表达量及其三种蛋白的磷酸化程度。
结果：
（1）提取到的金葡菌总RNA反转录得到cDNA，经高保真DNA聚合酶PCR，2%琼脂糖凝胶电泳结果可见扩增出约717bp的条带，与agrA的分子大小相当。琼脂糖凝胶DNA回收后，再用琼脂糖凝胶电泳验证，电泳结果中与目的基因大小相符，说明已经得到了agrAcDNA。
（2）agrA cDNA与pEASY-Blunt E1 Expression Vector质粒连接后转化至Trans1-T1感受态细胞中培养，取菌体用T7 Promoter Primer和agrA的反向引物进行PCR，琼脂糖凝胶电泳结果有与目的基因agrA大小相当的条带，提示目的基因agrA已经插入质粒载体中。
（3）重组质粒送至生物公司测序，测序结果与GeneBank公布的agrA基因碱基序列一致，因此，重组质粒pEASY/agrA已经构建成功。
（4）重组质粒pEASY/agrA转入BL21大肠杆菌中构建表达载体，诱导表达蛋白后，SDS-PAGE电泳发现，未用IPTG的阴性对照组没有产生agrA蛋白，而用IPTG诱导实验组表达出相对分子量为26kd的蛋白，这与目的蛋白agrA大小相符，说明表达载体构建成功。
（5）大量诱导表达的菌体裂解后，SDS-PAGE电泳发现agrA蛋白主要在上清表达，取菌体裂解到的上清液纯化，SDS-PAGE电泳图中，在26kd处有条带，这与目的蛋白大小一致。
（6）agrA作用于A549细胞后，western blotting法检测四组不同作用时间的β-防御素（1，2，3）的表达量，发现随着agrA蛋白作用于A549细胞时间的延长，β-防御素（1，2）的表达量基本恒定，而β-防御素3的表达量却显著增强；
（7）western blotting法检测四组不同作用时间MAKP通路上的关键蛋白ERK1/2、P38和JNK的表达量，随着作用时间的延长p-JNK/JNK、P38/p-P38的表达量基本无差异，p-ERK1/2/ERK1/2的表达显著增加。
结论：
（1）成功构建了含有agrA目的基因的重组质粒pEASY/agrA，并利用原核表达载体诱导表达并纯化了agrA蛋白。
（2）金黄色葡萄球菌agrA能够使A549细胞的β-防御素3表达量增加。
（3）金黄色葡萄球菌agrA可能是通过 MAPK信号通路中ERK1/2的磷酸化来调控诱导β-防御素3的表达。