中药干预鼠流感的作用及与粘膜免疫相关性研究

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目的:研究中医药预防流感作用;探讨中医药预防流感与黏膜免疫相关性;方法:一中药体外预防流感的作用以不同浓度的药物作用于细胞,在37℃,5%CO2条件下培养,观察细胞形态的变化,以MTT法检测药物的TC50。接种浓度为1×105个/mL的MDCK细胞100μL/孔于96孔微量培养板中,再加入不同浓度的药物,过夜后去掉上清液,每孔加入100μL含100TCID50的病毒,吸附2小时,每孔加入100μL不同浓度药物的维持培养基,4天后终止实验。实验设阳性组和正常细胞对照组。毒性作用和抗病毒作用分别以CPE镜下观察判定和鸡红血球凝集实验判定。依据前述实验获得的TC50结果及药物抗病毒作用的结果,选取体外有效药物的半数毒性浓度以下4个药物浓度梯度进行后续的抗流感病毒体外实验。二中药对流感病毒感染小鼠病毒性肺炎的抑制作用和死亡保护研究将NIH小鼠随机分11组,设为正常对照组、病毒对照组、阳性对照组、银翘散组(高中低剂量)、玉屏风散组(高中低剂量)高剂量、冰香散雾化组、冰香散滴鼻组。不同方药和不同给药方式预防性给药7天,之后用15LD50流感病毒液感染小鼠,继续给药5d,同时记录动物死亡数量和死亡时间,5d后称重颈椎脱臼处死剩余小鼠,取出肺组织并称重,用公式计算肺指数和肺指数抑制率。肺指数=(小鼠肺重/小鼠体重)×100;肺指数抑制率=(病毒对照组肺指数均值-实验组肺指数均值)/病毒对照组肺指数均值×100。对数据进行t检验,以P<0.05定为有统计学意义。三Real-time RT-PCR H1N1病毒载量测定雌性Balb/C小鼠70只,随机分为7组,分别为正常组、病毒对照组、阳性对照组、银翘散组、玉屏风散组、冰香散雾化组、冰香散滴鼻组,不同方药和不同给药方式预防性给药7天,之后用15LD50流感病毒液感染小鼠,继续给药5d。之后颈椎脱臼处死小鼠,打开胸腔,取出肺组织,将左肺叶放入2ml冻存管做病毒载量的测定,将右叶肺置入4%甲醛溶液中固定备用于病理切片。引物由Invitrogen公司合成,根据NCBI基因库中A/FM/1/47(H1N1)流感病毒mRNA序列设计上下游引物,BALST进行验证。并根据此序列设计一段特异性引物和GAPDH Primer (H1N1:Forward primer:AATGGTGCAGGCGATGAGAG Reverse primer: TACTTGCGGCAACAACGAGAG; GAPDH:Forward primer:CCTCGTCCCGTAGACAAAATG Reverse primer:TGAGGTCAATGAAGGGGTCG).从小鼠肺组织中以Trizol法提取总的RNA、逆转录(RT)、建立25μL反应体系如下:DNA模板1μL、SYBR Premix Ex TaqTMⅡ(2×)12.5μL、引物-10.5μL、引物-20.5μL、ROX0.4μL、ddH2010.1μL:总体积25μL,在ABI Step One QPCR仪上进行反应。PCR反应程序为:95℃15s、62.5℃30s、72℃癈30s,40个循环。绘制标准曲线,以此来定量待测样品浓度。四观察不同中药防治流感病毒感染小鼠后肺组织病理改变雌性BALB/c小鼠70只,随机分为7组,分别为正常组、病毒对照组、阳性对照组、银翘散组、玉屏风散组、冰香散雾化组、冰香散滴鼻组,不同方药和不同给药方式预防性给药7天,以流感病毒A/FM/1/47(HIM)鼠肺适应株感染除正常组以为组别的小鼠。感染后第5天对小鼠进行肺组织取材与固定,按冲洗,脱水,透明,浸蜡,包埋,切片,HE染色等常规操作处理肺组织病理切片,最后镜检得出结果。五中药预防流感作用与黏膜免疫相关性研究将BALB/c小鼠随机分7组,设正常组、病毒对照组、利巴韦林组、银翘散制剂、玉屏风散制剂、冰香散滴鼻组、冰香散雾化组。在乙醚轻度麻醉下,滴鼻感染15LD50流感病毒液,约0.05mL。在感染攻毒前提前给药一周,之后继续给药5d给药方法与剂量同前。感染后5d,颈椎脱臼处死小鼠,采血分离血清,收集鼻咽冲洗液、支气管肺泡灌洗液、肠道冲洗液按EIISA试剂盒要求检测IgA含量。于450nm波长处以酶标仪测定试样OD值,根据标准品的标准曲线换算IgA浓度。用SPSS18.0软件进行数据间的统计学处理,所测数据以x±s表示。IgA采用单因素方差分析(ANOVA),P<0.05为差异有统计学意义。结果:一体外实验结果显示玉屏风散制剂和银翘散制剂仅在毒性浓度下对流感有预防作用,无毒浓度下均不能抑制病毒;冰香散制剂在最小无毒浓度15.6μ g/ml时对流感病毒A/FM/1/47(H1N1)鼠肺适应株有较好的预防作用;阳性对照组药物利巴韦林在0.25mg/mL~2mg/mL浓度内均有良好的抑制流感病毒作用。二和病毒对照组相比,各实验药物组感染鼠肺重多呈不同程度减轻,银翘散与玉屏风散的肺指数抑制率达到35.4%~43.4%。冰香散(滴鼻给药和雾化给药)不同给药方式均可不同程度地降低肺指数。在死亡保护实验中,阴性组未感染病毒,无动物死亡;病毒对照组则15天之内全部死亡,死亡率为100%。利巴韦林对感染鼠死亡保护率为50%,银翘散制剂最高死亡保护率为50%~60%,玉屏风散最高死亡保护率为70%,冰香散滴鼻和冰香散雾化给药对感染鼠的死亡保护率分别为40%和70%。病毒感染对照组鼠平均生存时间在7.6d左右。而各试验药物组鼠平均生存时间均有不同程度的延长,大约在11d~13.4d左右。银翘散制剂、玉屏风散制剂和冰香散延长鼠生命率在50%以上,尤以玉屏风散制剂效果显著,达76.31%三病毒载量方面:用甲型H1N1流感病毒感染小鼠后,病毒对照组的病毒载量明显升高,而给予药物防治的所有组别都不同程度的降低了病毒载量,跟模型组比较,其差别有统计学上显著性意义(P<0.01)。四肺组织病理切片:模型组的小鼠在感染流感病毒A/FM/1/47(H1N1)鼠肺适应株后出现以炎症为主的各种病理改变,淋巴细胞侵润,细支气管上皮细胞坏死脱落并和炎性细胞聚集形成脓液。阳性对照组也出现某种程度的淋巴细胞为主的炎性细胞浸润。冰香散滴鼻和雾化组也出现肺部炎症的病理改变,较之模型中相对较轻。银翘散和玉屏风散肺炎和肺细支气管炎都较轻,但也有气管管腔分泌物和肺泡中有少许炎性细胞。五中药预防流感作用与黏膜免疫相关性研究显示,冰香散雾化给药对血清IgA水平表现为提升作用,与病毒对照组相比差异明显(P<0.01),利巴韦林组呈下降作用。鼻咽部sIgA水平方面:冰香散滴鼻给药能提升鼻咽部sIgA水平,较之病毒对照组差异明显(P<0.05)。支气管-肺泡sIgA水平方面:利巴韦林组呈降低作用,玉屏风散与冰香散雾化给药表现为提升作用,与病毒对照组差异明显(P<0.05)。肠道粘液sIgA水平方面:玉屏风散制剂与冰香散雾化表现一定的提升作用,与病毒对照组相比,差异明显(P<0.05~0.0.1)。其余各组差异不明显(P>0.05)。结论:银翘散,玉屏风散,冰香散对流感病毒A/FM/1/47(H1N1)鼠肺适应株感染小鼠有保护作用,能抑制病毒在肺组织中的复制,能减轻炎症引起的病理改变,并上调黏膜免疫相关部位的IgA和sIgA水平达到调节免疫的功效,故中医药能在流感病毒的预防和治疗上面起到明显的作用。
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