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实验一氯化锂-匹罗卡品致大鼠癫痫海马GPER1的表达及突触可塑性改变目的观察G蛋白偶联雌激素受体1(G protein-coupled estrogen receptor 1,GPER1)在颞叶癫痫大鼠海马神经元中表达的变化及突触可塑性变化。方法(1)分组:选取SD雄性大鼠56只,随机分为Control组(Control),癫痫1d组(1d group),癫痫2d组(2d group),癫痫3d组(3d group),癫痫7d组(7d group),癫痫14d组(14d group),癫痫28d组(28d group),每组8只;(2)经腹腔注射氯化锂-匹罗卡品(Lithium-pilocarpine)制作大鼠颞叶癫痫(Temporal lobe epilepsy,TLE)模型,通过Racine癫痫发作评分标准对模型进行评价;(3)运用Morris水迷宫检测大鼠学习与记忆能力改变;(4)运用尼氏染色观察各组大鼠海马神经元形态变化;(5)运用免疫组织化学方法和Western Blot技术分别观察GPER1、PSD95、SynapsinⅠ及Gephyrin在各组大鼠海马神经元中的表达特征及表达变化;(6)运用Timm染色观察各组大鼠海马苔藓纤维出芽情况;(7)运用Golgi染色观察各组大鼠海马神经元轴突与树突变化。结果(1)水迷宫结果表明,与Control组比较,造模14d的大鼠在60s内寻找到平台的时间延长,穿越平台的次数减少(P<0.05);(2)尼氏染色结果表明,Control组细胞排列紧密,染色均匀,造模1d的大鼠细胞排列稍变疏松,造模2d后尼氏体染色变淡,造模3d后细胞萎缩,数量减少,细胞间距增加,尼氏体染色变深,造模7d时细胞体积减小,造模14d后细胞开始恢复正常,尼氏体染色仍然较淡,造模28d后细胞排列基本恢复如常;(3)免疫组化结果显示,Control组免疫阳性表达位于胞膜,与Control组相比,造模2d时GPER1表达增高(P<0.05);造模3d时阳性在胞浆着色;造模14d后表达开始下降。PSD95阳性染色在各组大鼠海马CA3区呈片状分布,与对照组相比,造模1d时PSD95表达下降(P<0.05),造模2d时表达略为上升(P<0.05),造模7d、14d时表达恢复至Control水平,造模28d时表达再次下降(P<0.05)。造模1d的大鼠海马CA3区Synapsin I阳性表达显著减少(P<0.01),造模2d时表达开始上升(P<0.01),造模14d时趋近Control组,造模28d时表达水平再次下降(P<0.01)。Gephyrin免疫阳性染色主要表达于胞浆,造模1d时Gephyrin阳性表达显著增高(P<0.01),造模2d时阳性染色略有下降(P<0.01),造模3d时阳性表达下降(P<0.05),呈胞膜着色,造模7d是表达略有上升(P<0.05),造模14d时表达持续上升(P<0.01),造模28d时基本持平(P<0.01)。(4)Timm染色结果表明,在1d-2d(急性期)时,未见Timm颗粒,3d时,开始出现接近连续分布的Timm颗粒(P<0.01),7d以后,观察到条带状的Timm颗粒(P<0.01),28d时,则表现为接近连续分布的Timm银染颗粒(P<0.05)。(5)Golgi染色结果表明,在CA1区,1d大鼠海马神经元轴突变短,3d时树突减少,轴突缩短,7d时仅有少量树突,14d时轴突增长,28d时轴突逐渐延长,树突少量增加。在CA3区,1d神经元改变不明显,3d时树突开始减少,7d时树突大幅减少,轴突变短,14d时轴突稍有增长,树突数量增加,28d时改变基本与14d时持平。在DG区,造模1d、3d、7d、14d时神经元形态改变不明显,28d时可观察到树突略有减少。(6)Western Blot结果与免疫组化结果基本一致。结论(1)在癫痫发生发展过程中,GPER1参与了海马神经元损伤的修复;(2)癫痫致海马神经元轴、树突密度在7d时明显减少,以CA3区最为显著;癫痫慢性期可见DG区颗粒细胞及CA3区锥体细胞出现MFS;(3)反复癫痫发作,在急性期使海马突触前膜蛋白Synapsin I、兴奋性突触后膜蛋白PSD95、抑制性突触膜蛋白Gephyrin表达下调,静默期表达升高,慢性期表达下降,提示这些突触蛋白参与海马突触可塑性变化。实验二GPER1对颞叶癫痫大鼠海马神经元突触可塑性的影响目的探讨在大鼠颞叶癫痫发生发展过程中,GPER1对海马神经元突触可塑性的可能调控作用。方法(1)分组:选取雄性SD大鼠72只,随机分为DMSO癫痫2d对照组(DMSO2d group),2d癫痫G1干预组(G1 2d group),2d癫痫G15干预组(G15 2d group),DMSO7d对照组(DMSO 7d group),7d癫痫G1干预组(G1 7d group),7d癫痫G15干预组(G15 7d group),DMSO癫痫28d对照组(DMSO 28d group),28d癫痫G1干预组(G1 28d group),28d癫痫G15干预组(G15 28d group),每组8只;(2)经腹腔注射氯化锂-匹罗卡品制作大鼠颞叶癫痫模型,通过Racine癫痫发作评分标准对模型进行评价,侧脑室埋置给药套管,微量给药;(3)运用Morris水迷宫实验检测各干预组大鼠学习与记忆能力改变;(4)尼氏染色观察各干预组大鼠海马神经元细胞形态的改变;(5)免疫组织化学方法和Western Blot技术观察GPER1、PSD95、Gephyrin以及SynapsinⅠ在各组大鼠海马神经元中的表达特征与表达变化;(6)Timm染色观察各干预组大鼠海马苔藓纤维的异常出芽情况;(7)Golgi神经元纤维染色实验观察各干预组大鼠神经元轴突与树突的变化。结果(1)水迷宫:与DMSO 28d组比较,G1 28d组大鼠在60 s所需寻找平台时间显著缩短(P<0.01),G15 28d组则延长(P<0.05);G1 28d组大鼠在60s内穿越平台所在区域次数明显增加(P<0.05),G15 28d组则减少。(2)尼氏染色:DMSO 2d组CA1区细胞数量见少、排列疏松,CA3区细胞数量减少,部分深染,DG区亦观察到少量浓集深染细胞;G1 2d组CA1区细胞排列整齐,形态饱满,尼氏体染色均匀,CA3区锥体细胞层排列紧密,与Control组相近,DG区颗粒细胞层排列紧密,染色趋近正常。G15 2d组三个区域的细胞损伤较DMSO 2d组更严重。DMSO 7d组三区域细胞改变与造模7d尼氏染色的细胞损伤类似,CA3区则更加严重,G1 7d组三个区域细胞数量增多且排列紧密,G15 7d组三个区域的细胞数量则急剧减少,排列紊乱,尼氏体染色较G1 7d组变淡。DMSO 28d组三个区域细胞层变薄尼氏体深染,G1 28d组三区细胞排列整齐,而G15 28d组CA1区细胞染色变淡,排列疏松,CA3及DG区细胞损伤较CA1区稍轻;(3)免疫组化结果:与DMSO组相比,在癫痫2d、7d、28d三个时间点G1干预组GPER1阳性细胞表达明显上升(P<0.05),G15干预组则表达降低(P<0.05),未观察到GPER1阳性表达转移至胞浆现象。与DMSO组各时间点比较,G1干预组大鼠海马PSD95表达水平下降(P<0.05)。同样,与DMSO组个时间相比,三个时间点的G1干预组大鼠海马SynapsinⅠ的表达均降低(P<0.01)。与DMSO组相比,2d时G1干预组大鼠海马Gephyrin表达明显降低(P<0.05);7d时则明显上升(P<0.05);28d时再次降低。(4)Timm染色结果:与DMSO组相比,三个时间点G1干预组的Timm评分明显降低(P<0.05),G15组Timm评分显著升高(P<0.01)。(5)Western Blot结果:与DMSO组相比,三个时间点G1组GPER1表达均升高(P<0.05),G15组均下降(P<0.05);PSD95:与DMSO组相比,G1 2d组表达下降,G1 7d组继续下降(P<0.05),G1 28d组表达略有上升(P<0.05),G15 2d组表达下降,G15 7d表达显著下降(P<0.05),G15 28d组表达回升;SynapsinⅠ:与DMSO组比较,G1 2d组表达下降(P<0.05),G1 7d组略有上升(P<0.05),G1 28d组继续上升(P<0.05),G15 2d组表达下降(P<0.05),G15 d组略上升(P<0.05),G15 8d组持平;Gephyrin:与DMSO组相比,G1 2d组略下降,G1 7d组显著上升(P<0.01),G1 28d组再次下降(P<0.05),G15 2d组表达与DMSO组持平,G15 7d组显著下降(P<0.01),G15 8d组表达回升。Golgi染色结果:在CA1区,DMSO28d癫痫对照组神经元密度稀疏,轴突变短,树突分支减少,G1 28d组神经元较密,轴突延长,树突网密集有序,而G15 28d组则树突网较少。在CA3区,DMSO 28d组树突大量减少,G1 28d组轴突较长,树突网有所恢复,密度增加,G15 28d组则稀疏,缩短。DG区中,各组变化则不明显。结论(1)GPER1选择性激动剂G1可明显改善癫痫大鼠的学习与记忆损害;(2)G1可明显改善癫痫造成的大鼠海马神经元受损情况,G15可抵消G1对于海马神经元的保护作用;(3)G1可改善癫痫所致大鼠海马异常苔藓纤维的形成;(4)G1可能通过降低Synapsin I及调高Gephyrin的表达水平参与突触可塑性的修复,且抑制性突触Gephyrin可能作用显著。