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白细胞介素-17(Interleukin-17,IL-17)是Th17细胞的特征性细胞因子,被认为是一种关键的促炎性细胞因子,在宿主抵抗胞外菌、真菌感染,以及炎症、超敏反应、自身免疫病等多种疾病过程中均起到了重要的作用。山羊的很多炎症性疾病如乳腺炎是损害山羊健康,制约养羊业健康发展的重要因素。但IL-17与山羊乳腺炎等炎症性疾病之间关系的基础研究还比较少,缺乏有效的山羊IL-17单克隆抗体是阻碍IL-17相关山羊疾病机理深入研究的一个重要原因。本研究根据Gen Bank公布的奶山羊IL-17A CDS区序列(不含信号肽序列)设计原核表达引物,从Con A活化的奶山羊外周血单个核细胞中提取细胞总RNA,反转录PCR法扩增目的基因,连接到原核表达载体p ET 32a后将重组质粒转入大肠杆菌Tans B(DE3)感受态细胞进行原核表达,并对原核表达条件进行了优化,实现目的蛋白的可溶性表达,并对纯化条件进行了优化。随后,本研究以纯化的原核表达重组山羊IL-17A(r IL-17A)免疫BABL/c小鼠,使用免疫小鼠的脾细胞与SP2/0细胞融合,最终筛选出能分泌抗羊IL-17A单克隆抗体的融合杂交瘤细胞。将制备的杂交瘤细胞注射入BABL/c小鼠体内制备腹水,用饱和硫酸铵法进行腹水的纯化,并对抗体的类别和亚型进行鉴定。为验证制备的单克隆抗体在实践中的应用性,本研究首先制备了真核表达的山羊IL-17A蛋白,以代替天然的山羊IL-17A蛋白。根据Gen Bank公布的奶山羊IL-17A完全CDS区序列设计了真核表达引物,扩增出目的片段后连接于真核表达载体p EGFP-N1,并转入大肠杆菌Trans5α感受态细胞保存,将鉴定正确的重组质粒命名为IL-17A-p EGFP-N1。将重组质粒转染入HEK293T细胞进行瞬时表达,收取真核表达上清,并以制备的单克隆抗体为一抗,用Western bolt方法检测分泌上清中的IL-17A蛋白,用免疫荧光方法检测IL-17A~+293T细胞。随后,选取成年健康奶山羊,通过乳导管灌注金黄色葡萄球菌制备临床奶山羊乳腺炎模型,采患病羊乳腺组织为样品,以纯化的腹水为一抗,分别用免疫荧光和免疫组化方法检测组织样品中的天然IL-17A~+细胞。为探究IL-17A对乳腺上皮细胞免疫防御功能的影响,重新选取处于泌乳活跃期的成年健康奶山羊,无菌采取乳腺实质组织,通过组织块贴壁法制备原代山羊乳腺上皮细胞(Goat mammary epithelial cells,GMEC)。用IL-17A真核表达上清刺激山羊乳腺上皮细胞,通过Real-Time PCR方法检测GMEC分泌的各种促炎性细胞因子、趋化因子、防御性蛋白,以及凋亡和增值相关因子的m RNA表达水平变化情况。获得的研究结果如下:1.克隆了山羊IL-17A的CDS区基因(不含信号肽序列),并建立了原核表达体系;对诱导表达条件进行优化,发现IL-17A-p ET 32a-Trans B(DE3)重组菌在16℃、0.3 mmol/L的条件下诱导42 h时,可溶性目的蛋白的表达效果良好;优化后的纯化条件为:80 mmol/L咪唑溶液洗脱杂蛋白,500 mmol/L咪唑溶液洗脱目的蛋白;2.获得2株能稳定分泌特异性山羊IL-17A抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为B1和H9。B1和H9融合细胞染色体数目分别大约为96条和82条,分泌的抗体均为Ig G1亚类,轻链均为κ型;B1、H9融合细胞上清ELISA效价分别为1:2~8、1:2~9,ELISA检测未纯化的小鼠腹水效价分别为1:10~6、1:10~7,纯化后效价均为1:10~6;仅H9细胞分泌的抗体可应用于进一步的研究;3.建立了山羊IL-17A真核表达体系,以H9细胞分泌的抗体为一抗,用western blot方法检测到了IL-17A-p EGFP-N1-293T细胞分泌上清中的IL-17A蛋白,并且抗体的特异性良好;用免疫荧光方法检测到了转染成功的IL-17A~+293T细胞,并且抗体的特异性良好;4.建立了金黄色葡萄球菌性临床奶山羊乳腺炎模型,以H9细胞分泌的抗体为一抗,分别用免疫荧光和免疫组化方法检测到了临床乳腺炎奶山羊乳腺组织中的天然IL-17A~+细胞;5.制备了原代山羊乳腺上皮细胞,用IL-17A真核表达上清刺激山羊乳腺上皮细胞,发现IL-17A可以促进山羊乳腺上皮细胞分泌多种促炎性细胞因子、趋化因子和防御性蛋白;IL-17A对于细胞凋亡和增殖相关因子的分泌无明显影响。据此得出如下结论:1.建立了山羊IL-17A的可溶性原核表达体系及相应的纯化体系;2.筛选到2株能稳定分泌特异性山羊IL-17A单克隆抗体的杂交瘤细胞B1和H9,其中H9细胞分泌的抗体可以用于免疫荧光检测、免疫组化检测和western blot检测;3.建立了山羊IL-17A真核表达体系,并以H9抗体为一抗检测到了转染细胞分泌上清中的IL-17A蛋白和转染成功的IL-17A~+细胞;4.IL-17A可以促进山羊乳腺上皮细胞分泌多种促炎性细胞因子、趋化因子和防御性蛋白,是介导乳腺免疫的重要细胞因子。