研究背景:肠道病毒71 型(enterovirus 71,EV71)是引起手足口病(hand,foot,and mouth disease,HFMD)和导致严重神经系统并发症的常见病原体,主要流行于亚太地区。婴幼儿感染EV71引起的HFMD可能导致严重并发症,包括心肌炎、急性弛缓性麻痹、无菌性脑膜炎、脑干脑炎、神经源性肺水肿甚至死亡。EV71主要感染5岁以下儿童及婴幼儿,通常成人不易感。小鼠模型中,EV71只对14日龄以下免疫系统正常小鼠易感致死,对14日龄以上小鼠不易感。随着不同小鼠适应株的建立及不同感染方法的改进,EV71可感染小鼠的日龄不断增大。从最初的1日龄小鼠模型,到后来的5日龄、7日龄、10日龄、14日龄小鼠模型,虽然小鼠可感染日龄不断增加,但小鼠日龄依然是限制小鼠EV71易感性的十分关键的因素。由此推测,小鼠的发育过程对EV71易感性有着巨大的影响。在小鼠出生后的发育过程中,身体各个系统都在发生变化,代谢水平与方式、共生微生物的种类与数量、组织器官的结构与功能等各个方面都在变化。在这些变化之中,就存在着影响小鼠EV71易感性的因素。研究目的:目前普遍认为,在EV71感染疾病进程中,固有免疫发挥极为重要的抗病毒作用。因此推测,在发育过程中各种影响EV71易感性的因素中,免疫系统的成熟必定有着十分重要的作用。在免疫器官中,肠道为第二大免疫器官,行使重要的免疫功能,同时其为EV71自然感染过程中病毒首先感染的器官,是EV71感染初期重要的靶器官和病毒复制场所。因此本研究重点分析了不同日龄小鼠的肠道免疫发育情况,以期寻找到肠道发育过程中影响EV71易感性及疾病进程的关键因素。通过组织RNA组学分析,我们推测其中一条与ILC3s相关的免疫功能通路在EV71感染过程中发挥了重要的作用。同时,本研究利用不同日龄的EV71小鼠感染模型对这一推测进行了验证。研究方法:模型优化:优化EV71小鼠模型。首先应用临床病人体内分离的EV71病毒经腹腔注射感染小鼠,观察小鼠感染EV71病毒后的临床症状;检测EV71病毒在小鼠组织中的分布和复制动力学变化;检查感染导致组织脏器的病理损伤;监测组织器官中免疫细胞变化;监测组织器官中细胞因子mRNA表达变化。建立小鼠感染EV71病毒动物模型监测指标并获得模型分析数据。小鼠免疫发育分析:对1、7、14、18、21日龄小鼠的脾、淋巴结、胸腺、肠、骨髓进行组织病理学分析、流式细胞分析及组织mRNA及lncRNA组高通量测序分析。关键免疫因素分析:通过对小鼠出生后肠道免疫发育观察分析,筛选出可能的对EV71易感性产生重大影响的细胞因子或细胞。对7、14、18、21日龄模型,进行感染前后mRNA及lncRNA组高通量测序比对分析。通过免疫功能网络分析推测可能的关键细胞因子、免疫细胞。在小鼠模型中通过组织细胞因子RNA PCR检测和流式细胞分析验证测序分析结果。结果:模型优化:EV71感染小鼠模型的主要临床表现为体重下降、后肢瘫痪、眼部病变及死亡。通过建立EV71临床分离株的鼠适应株,首次建立了 15-18日龄BALB/c小鼠致死模型及19-21日龄眼部病变感染模型。15-18日龄小鼠感染后7天内致死率100%,全部出现体重下降、后肢瘫痪和眼部炎症。19-21日龄小鼠模型无死亡,感染后表现为竖毛、眼部炎症,感染后5天内均可在眼部黏膜检测到排毒。小鼠免疫发育分析:本研究通过对1至21日龄BALB/c小鼠的免疫发育过程进行观察,建立了小鼠出生后免疫发育过程基本资料集合。小鼠组织病理检测结果显示,18日龄小鼠骨髓55细胞比例与数量接近成年小鼠。7日龄小鼠胸腺出现明显的皮质区与髓质分界,结构接近成熟。7日龄小鼠脾脏开始出现动脉周围淋巴鞘与脾小结,边界不明显;14日龄小鼠脾脏动脉周围淋巴鞘与脾小结出现明显边界,18日龄小鼠脾脏动脉周围淋巴鞘与脾小结接近成熟。7日龄小鼠小肠开始出现黏膜下淋巴小结,14日龄小鼠小肠开始出现集合淋巴小结,21日龄小鼠集合淋巴小结出现类生发中心结构,但未发育成熟。14日龄小鼠淋巴结开始出现明显淋巴小结,18-21日龄小鼠淋巴结接近成熟,但未出现生发中心。流式细胞分析结果显示,在脾脏、淋巴结、骨髓及胸腺中,不同日龄间比较,B细胞、αβT细胞、γδT细胞、DC细胞、NK细胞,所占比例相似。其中,脾脏中B细胞所占比例最大,胸腺与淋巴结中CD4+T细胞所占比例最大。而在1-7日龄小鼠小肠中,所检测的免疫细胞比例相近;14-21日龄小鼠小肠中各种免疫细胞比例差据距随日龄增加逐渐增大。小鼠小肠组织RNA组高通量测序分析发现,1日龄、7日龄和14日龄小鼠与18日龄和21日龄小鼠小肠RNA表达呈现不同模式。证明14日龄前后小鼠小肠的基因表达呈现不同模式,小鼠小肠的发育可能进入了新的阶段。关键免疫因素分析:通过对小鼠出生后免疫器官及细胞发育分析,发现在7、14、18及21日龄小鼠中,小肠的组织结构及免疫细胞群比例均有比较显著的变化。进一步对不同日龄小鼠模型感染前后小肠RNA组进行高通量测序分析发现,与ILC3s相关的细胞因子基因表达量具有显著性差异。因此推测,可能存在某一以ILC3s为中心的功能通路或功能网络在EV71感染疾病进程中发挥重要作。通过流式细胞术及细胞因子RNA相对表达量检测分析发现,ILC3s及其相关细胞因子在感染前后,出现与小鼠日龄具有相关性的,显著性变化。小鼠感染EV71后,ILC3s损失率及IL-22表达增高倍数与小鼠死亡速率、临床评分上升速率及组织病理损伤程度正相关。证明与ILC3s及其相关细胞因子IL-22在EV71感染疾病进程中发挥重要作用。同时证明了存在以ILC3s为中心,由IL-1β、IL-23、ILC3s、IL-22、TNF α、小肠黏膜上皮细胞及IL-10组成的功能网络,且该功能网络在EV71感染疾病病理过程中发挥了重要的作用。结论:1.本研究建立了肠道病毒71型(EV71)小鼠适应株,证明病毒基因组变异对其致病力产生巨大影响。因肠道病毒基极易发生变异和重组,临床及疾病预防控制工作中,对肠道病毒特别是EV71的病原学监控十分重要。2.本研究利用小鼠适应株建立了不同发育阶段的多种EV71小鼠感染模型,为EV71相关研究提供了丰富的研究工具。首次建立了 15-18日龄EV71小鼠致死模型与19-21日龄EV71小鼠感染模型,为研究出生后发育后期机体与EV71相互作用提供可能。3.本研究通过对不同日龄小鼠进行免疫器官的组织病理学及细胞学分析,发现在EV71小鼠感染模型建立过程中的几个关键时间点上(7、14、18及21日龄),小肠的黏膜下淋巴结组织结构及小肠中免疫细胞群比例均有比较显著的变化。4.通过组织RNA组高通量测序分析推测及流式细胞术与细胞因子RNA相对表达量检测验证,推测出存在以ILC3s为中心,由IL-1 β、IL-23、ILC3s、IL-22、TNFα、小肠黏膜上皮细胞及IL-10组成的功能网络,并提供了一定的实验证据。同时提示了该功能网络在EV71感染疾病病理过程中发挥了重要的作用。IL-1β、IL-23、IL-22、TNFα、及IL-10可能成为识别重症病例的潜在标志物。5.小鼠出生后免疫发育影响小鼠对EV71易感性及感染后疾病进程。固有免疫特别是固有淋巴细胞3群(ILC3)对小鼠EV71易感性及感染后疾病进程发展产生重要影响。