结肠癌全球高发,常规治疗后往往发生复发和转移,治愈率低,致死率世界排名第四。肿瘤干细胞(Cancer Stem Cells,CSCs)是肿瘤组织中具有自我更新、多向分化潜能、无限增殖能力、转移和耐药特征的数量极少的细胞群,是肿瘤发生、发展、复发和转移的决定性因素。因此深入研究肿瘤干细胞调控机制有助于设计针对肿瘤干细胞的治疗策略。肿瘤干细胞处在一个由内皮细胞、成纤维细胞、炎性细胞和胶质细胞等组成的微环境“niche”中。肿瘤干细胞微环境介导的基因表达异常是肿瘤演变过程中重要分子事件。微环境中的炎性因子通过激活肿瘤干细胞相关通路,如Notch、Hedgehog、STAT3和NF-κB,实现对CSCs的调控;同时CSCs通过分泌细胞因子对自身所处的“niche”进行改造。研究肿瘤干细胞如何应对肿瘤微环境中的炎症信号,以及如何通过自分泌和旁分泌的方式对微环境产生影响是本课题的研究方向。在细胞分泌途径中Rab蛋白家族发挥着重要作用。Rab为小GTP酶,属于Ras超家族,主要负责细胞内囊泡运输,Rab27是其中主要负责细胞内物质分泌的蛋白,有两个异构体Rab27A和Rab27B。Rab27A功能失常会引发疾病的发生,如格里塞利综合征和代谢综合症。在肿瘤研究领域,过表达Rab27A促进乳腺癌和黑色素瘤的生长和转移。Rab27A以外泌体依赖和非依赖的方式对肿瘤微环境进行改造,为肿瘤的发展和转移提供条件。本研究旨在回答rab27a是否影响结肠癌干细胞的功能?其机制是否与细胞因子分泌有关?炎症信号nf-κb是否影响rab27a的表达?【目的】1)利用结肠癌临床样本,肿瘤细胞系和肿瘤干细胞微球培养模型,检测rab27a与肿瘤恶性程度以及肿瘤干细胞干性是否存在相关性。2)干预rab27a是否对ht29肿瘤干细胞干性和增殖有影响?3)在上述功能变化的基础上,回答rab27a影响肿瘤干细胞的功能是否与细胞因子分泌有关。4)最后探讨肿瘤干细胞的炎症微环境是否参与影响rab27a在肿瘤干细胞中的表达水平。【方法和结果】1)免疫组织化学染色结果显示,在结肠癌临床样本中rab27a染色阳性率为66.7%。6株结肠肿瘤细胞系均能在肿瘤干细胞微球(tumorsphere)培养体系中生长,但是球体形状不同;流式细胞术结果表明,这6株细胞系中干性标志分子cd44+细胞比例与肿瘤的恶性程度呈正相关性;rt-pcr和westernblot结果显示,rab27a的表达水平与结肠癌的恶性程度呈正相关性。2)流式细胞术结果显示ht29sphere中干细胞标志物cd44+和pkh26high细胞比例明显高于贴壁肿瘤细胞;rt-pcr结果显示,与贴壁ht29细胞比较,肿瘤干细胞标志分子在传代的sphere中表达升高,而分化标志分子表达降低。该结果表明通过肿瘤干细胞微球培养体系获得的ht29sphere具有干性特征。3)rt-pcr和westernblot结果显示,在ht29sphere中rab27a的表达高于贴壁ht29细胞;过表达rab27a使ht29sphere形成数目和体积增加;流式细胞术结果显示,过表达rab27a使ht29肿瘤细胞中cd44+和pkh26high细胞比例升高。rt-pcr和westernblot结果显示过表达rab27a使周期相关蛋白cyclind和cdk4表达升高,而p27表达降低;流式细胞术结果显示,过表达rab27a后ht29肿瘤细胞和sphere细胞中s期细胞比例升高。同时,干涉rab27a后得到与过表达反向的结果。4)过表达rab27a的sphere培养上清促进了ht29sphere的生长。elisa结果显示,过表达rab27a的sphere培养上清中vegf和tgf-β的浓度升高。我们通过激光共聚焦显微镜观察到,Rab27A呈现细胞核周单侧聚集分布,分布密度由细胞核向细胞膜依次递减;Rab27A表达水平高的细胞群中PKH26high细胞比例增加。该结果说明Rab27A通过促进细胞因子的分泌影响肿瘤干细胞的功能。5)体内功能实验表明,100个HT29 sphere细胞即可在免疫缺陷小鼠体内成瘤。过表达Rab27A后,HT29肿瘤细胞和肿瘤干细胞在裸鼠体内生长加快。CD31免疫组化结果显示,过表达Rab27A组中血管生成高于对照组,可能与Rab27A促进VEGF分泌有关。6)RT-PCR和Westernblot结果显示,HT29 sphere中p65表达高于正常HT29细胞。双荧光素酶报告实验显示,HT29 sphere细胞中NF-κB信号通路活性高于正常HT29细胞。此外,RT-PCR结果显示NF-κB下游靶基因IL-6的表达在传代的HT29sphere中升高。7)RT-PCR和Western blot结果显示,过表达p65后Rab27A表达升高,而NF-κB信号通路抑制剂PDTC和BAY-11-7082使Rab27A表达降低。双荧光素酶报告结果表明,p65使Rab27A启动子转录活性升高,而PDTC和BAY-11-7082使p65介导的Rab27A启动子转录活性降低。8)HT29肿瘤干细胞经TNFα处理后,球体生长速度加快;流式结果显示CD44+和PKH26high细胞比例升高;双荧光素酶报告结果显示HT29 sphere中NF-κB信号通路活性升高,同时RT-PCR和Western blot结果显示p65和Rab27A的表达升高。【结论】本课题首次确定了Rab27A促进了结肠癌干细胞的干性和增殖,并促进了结肠癌肿瘤细胞的生长。同时我们发现TNFα介导的NF-κB信号通路活化使HT29 sphere中p65表达升高,从而使Rab27A的表达升高,促进了VEGF和TGF-β的分泌,最终使HT29肿瘤干细胞的干性增加,增殖加快。本课题首次阐明炎症通过促进细胞分泌蛋白Rab27A的表达来增强细胞因子的分泌参与调控结肠肿瘤细胞的干性,为肿瘤干细胞的研究开拓了新的角度。