【摘 要】
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鸡毒支原体（Mycoplasma gallisepticum,MG）又称为败血霉形体,可引起鸡慢性呼吸系统疾病,导致鸡免疫力降低、免疫器官受损,常继发其他病原体感染,使症状加重,死亡率升高,给养禽业造成巨大经济损失。自噬是一种细胞自我保护机制,通过消除入侵病原体和死亡诱导信号确保细胞存活,对于调节宿主的免疫应答具有重要作用,但自噬在MG感染导致禽类免疫抑制中的作用尚不明确。本研究拟建立MG感染鸡巨
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鸡毒支原体（Mycoplasma gallisepticum,MG）又称为败血霉形体,可引起鸡慢性呼吸系统疾病,导致鸡免疫力降低、免疫器官受损,常继发其他病原体感染,使症状加重,死亡率升高,给养禽业造成巨大经济损失。自噬是一种细胞自我保护机制,通过消除入侵病原体和死亡诱导信号确保细胞存活,对于调节宿主的免疫应答具有重要作用,但自噬在MG感染导致禽类免疫抑制中的作用尚不明确。本研究拟建立MG感染鸡巨噬细胞（HD11）体外模型,检测MG感染不同时间点细胞内自噬水平以及ROS/NF-кB/NLRP3通路相关因子表达水平变化,探究MG感染对自噬的影响,分析自噬与免疫抑制之间的关系及作用机制,并通过MG感染鸡体内模型进行验证,从体外与体内两方面进行MG感染致鸡免疫抑制的机制研究,为MG感染的防治提供理论基础。本研究选取HD11细胞进行体外实验。使用不同MOI的MG Rlow株菌液（1×10~9CCU/m L）感染HD11细胞,经CCK-8实验确定MG最佳感染剂量为400 MOI,选取1、4、8、12 h为MG感染时间。ELISA结果显示,MG感染导致HD11细胞上清液中抗氧化酶活性降低,氧化应激产物含量增加,促炎因子含量增加,抗炎因子含量下降;JC-1和DAFH-DA荧光探针处理细胞发现,与对照组相比,MG感染组细胞内线粒体膜电位（ΔΨm）显著降低（p＜0.05）、ROS含量显著增加（p＜0.05）;超微结构观察结果显示,MG感染导致HD11细胞超微结构发生变化,出现线粒体嵴断裂、线粒体空泡化、细胞质空泡、核膜消失等病理损伤现象。上述结果表明MG感染导致HD11细胞内受损线粒体数量增加,ROS大量累积,发生氧化应激和炎症损伤。RT-q PCR和Western blot检测结果显示,与对照组相比,MG感染后1、4、8 h细胞中自噬相关因子的表达水平增加,而m TOR和p62的表达水平下降,12 h细胞中自噬相关因子的表达水平下降,而m TOR和p62的表达水平增加;MG感染组HD11细胞中TLR2-NF-κB、NLRP3相关因子表达水平在4个时间点均增加,且在12 h时表达差异最显著。结果表明MG感染HD11细胞后细胞自噬水平在感染1、4、8 h上升,在12 h下降,且MG感染可激活细胞中NF-κB和NLRP3信号通路。本研究根据实验室前期结果采用白来航雏鸡构建MG感染体内模型,并在感染后1、3、7 d收集胸腺。ELISA检测结果显示,与对照组相比,在三个时间点MG感染组鸡胸腺中的抗氧化酶活性降低,氧化应激产物含量增加。组织病理学和超微结构观察结果表明,MG感染导致鸡胸腺出现炎性细胞浸润,毛细血管扩张、充血,细胞间隙增大;胸腺淋巴细胞出现线粒体嵴断裂、空泡化,核周间隙增大,染色质边缘化,核仁破裂等病理损伤现象,表明MG感染破坏鸡胸腺组织结构,造成病理损伤。RT-q PCR检测结果显示,与对照组相比,三个时间点MG感染组胸腺中自噬相关因子m RNA表达水平均下降,而m TOR的m RNA表达水平均上升,TLR2-NF-κB、NLRP3相关因子m RNA表达水平均上升。Western blot检测结果显示,与对照组相比,感染7 d时MG感染组胸腺中自噬相关因子蛋白表达水平均下降,而m TOR的蛋白表达水平显著上升（p＜0.05）,TLR2-NF-κB、NLRP3相关因子蛋白表达水平均上升。结果表明MG感染导致鸡胸腺自噬水平下降,并激活NF-κB和NLRP3信号通路。综上所述,MG感染导致鸡胸腺出现明显的病理损伤,大量炎性细胞浸润,毛细血管扩张,HD11细胞超微结构发生改变,线粒体损伤,线粒体膜电位降低,损伤线粒体数量增加,ROS增加,表明MG感染可损伤鸡免疫器官和免疫细胞。在MG感染前期（1、4、8 h）,HD11细胞识别病原入侵并激活细胞自噬,随着感染时间的增加MG感染抑制HD11细胞自噬;且体内研究发现MG感染1、3、7 d胸腺组织自噬水平均下降,HD11细胞和胸腺组织中NF-кB/NLRP3信号通路异常激活,表明MG通过抑制自噬溶酶体的形成,增加受损线粒体数量促进免疫细胞和免疫器官的炎症损伤。本研究为MG感染所致免疫抑制提供理论基础和研究证据,为MG感染的治疗与药物开发提供了新思路。
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