宫颈癌是女性四大恶性肿瘤之一。是导致女性癌症死亡的主要原因之一,目前在全世界女性恶性肿瘤的发病率中占第四位。在发展中国家,女性子宫颈癌已成为发病率第二的妇科肿瘤仅次于乳腺癌,对广大女性的生命和健康产生严重的危害。据统计数据显示,2018年全世界约有57万宫颈癌新发病例,因为宫颈癌死亡的女性约31万人^[1]。其中有13万新发病例在中国,约占到全世界宫颈癌新发病例的1/3,而且其趋势呈逐年上升状态。白细胞介素-1（IL-1）是一种高活性的促炎细胞因子,能促进组织损伤和降低痛阈。其中两个功能相似的分子IL-1α和IL-1β分别由不同的基因（分别是IL-1A和IL-1B）编码。在传递信息,激活与调节免疫细胞,介导T、B细胞活化、增殖与分化及在炎症反应中起重要作用。它是由多种细胞产生并作可用于多种细胞的一类细胞因子,IL-1β功能繁多不仅在炎症和免疫反应中起作用,而且在自身免疫性疾病的发病机制中也起作用,其功能关系免疫反应的表达和调节,这种调节作用来源于淋巴细胞或巨噬细胞等的许多因子的参与,它参与了人类的抗感染、抗肿瘤、急慢性炎症等生物过程中^[2]。IL-1β可以与IL-1R1和IL-1R2结合,进一步激活下游MAPK、NF-κB等相关的信号通路,诱导下游趋化因子GRO-2、CXCL9的合成表达^[3,4,5]。趋化因子是由单核、成纤维细胞、肿瘤细胞和中性粒细胞等分泌的一种功能似、结构相同、分子量较小的细胞生物活性因子^[6]。在对肿瘤的影响上,趋化因子可以通过间接或直接的作用方式实现:（1）肿瘤的恶化和转变、癌细胞存活及生长、肿瘤侵袭和转移等生物特性受到趋化因子的直接影响;（2）而肿瘤血管生成以及与肿瘤组织的相互作用则是通过趋化因子间接的影响。同时,趋化因子成员作用复杂,具有双向的调节作用,有些因子可以直接促进肿瘤的形成和生长,而有一些因子则会增强机体免疫力,抑制肿瘤形成和生长。因此,研究在肿瘤发生发展过程当中趋化因子的作用对肿瘤的发生、进展、治疗和转归有着极其重要的意义。CCL-2/MCP-1即MCP-1,单核细胞趋化因子-1（monocyte chemoattractant protein-1,MCP-1）,是单核细胞的主要趋化因子,也是CC趋化因子家族成员之一,主要参与体内免疫、炎症调节。以前认为仅仅单核细胞、巨噬细胞、纤维母细胞、内皮细胞在内的数种细胞可以产生MCP-1;但随着对CCL-2/MCP-1研究的不断深入,越来越多证据表明在多种组织的肿瘤细胞中也存在CCL-2/MCP-1高表达。其中IL-1α,IL-1β,IL-8,IL-12,IL-15,TGF-β1和MCP-1的mRNA在宫颈癌细胞系中大多细胞均可表达。但与其他细胞因子相反,MCP-1仅产生于30%的正常宫颈上皮细胞中。NF-κB是转录因子家族中的一员,其作用主要表现在促进炎症发展、调节细胞凋亡和肿瘤免疫反应当中^[7]。1986年在B淋巴细胞的细胞核中Sen和Baltimore等第一次发现了NF-κB^[8]。NF-κB是由不同的亚基构成的一个具有保守中心区域的蛋白质家族,称为Rel同源结构域,它涉及DNA结合、与IκB分子的相互作用和二聚反应。哺乳动物NF-κB家族目前有5个成员:p50/p105、p65/RelA、c-Rel、RelB和p52/p100。NF-κB作为缺氧调节转录因子,控制HIF-1α的表达,从而作为缺氧反应的重要调节因子。它们表明了促瘤炎症和缺氧反应这两种应激反应与肿瘤的发生发展存在着紧密的联系^[9]。NF-κB的活化与多种肿瘤细胞分化侵袭相关,有宫颈癌研究中,NF-κBp65在Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ级宫颈癌组织中的表达较正常宫颈组织明显增强,提示NF-κB p65的表达与肿瘤分级有关。在HeLa和CaSki细胞中,NF-κB p65的过表达明显增强了宫颈癌细胞的侵袭和迁移^[10,11]。针对以上MCP-1在宫颈癌细胞系中表达的问题,本研究通过体外实验的方式,采用炎性因子IL-1β刺激人宫颈癌细胞HELA表达CCL2/MCP-1。进一步检测细胞内CCL2/MCP-1 mRNA的表达水平来验证CCL2/MCP-1释放量增多是来源于HELA细胞中原有CCL2/MCP-1蛋白的释放还是有新的CCL2/MCP-1合成。并且通过Western blot检测宫颈癌细胞HELA的p-NF-kBp65蛋白表达变化情况。以及TPCA-1（NF-kB阻断剂）对IL-1β诱导人宫颈癌细胞分泌CCL2/MCP-1的影响,从而初步探讨炎性因子IL-1β刺激人宫颈癌细胞HELA分泌CCL2/MCP-1的机制及可能的细胞通路。第一部分IL-1β刺激人宫颈癌细胞HELA分泌CCL2实验目的:探讨炎性因子IL-1β对人宫颈癌细胞HELA分泌CCL2/MCP-1的影响。方法:1、培养传代宫颈癌HELA细胞10%FBS DMEM的完全培养基培养传代宫颈癌HELA细胞保证后续实验的顺利进行,做好贮存足够多的且细胞代数为前几代的细胞。2、检测IL-1β刺激人宫颈癌细胞HELA后CCL2/MCP-1的表达。不同浓度的IL-1β作用人宫颈癌细胞HELA,IL-1β（10ng/ml）以不同时间作用人宫颈癌细胞HELA。收集的细胞培养上清液,应用ELISA法检测CCL2含量。结果:1、IL-1β不同浓度对人宫颈癌细胞HELA释放CCL2/MCP-1蛋白水平的影响。IL-1β能够诱导CCL-2/MCP-1的释放,且CCL2/MCP-1的分泌量随IL-1β作用的浓度增加而增多,呈现明显的浓度相关性。当浓度达到10ng/ml时CCL2/MCP-1释放量为该细胞基础分泌量的2.07倍（P<0.05）。2、IL-1β（10ng/ml）不同时间对释放CCL2/MCP-1蛋白水平的影响。实验结果表明在IL-1β作用下实验组与对照组相比CCL2/MCP-1的分泌量可随的时间延长而增多,而且具有明显时间依赖性（P<0.05）。小结:人宫颈癌细胞HELA在IL-1β刺激之下,通过ELISA实验技术检测CCL2/MCP-1蛋白表达水平。不同浓度和相同浓度不同刺激时长能够诱导CCL2/MCP-1表达显著增高,进而影响到有利于肿瘤细胞的募集作用。激活肿瘤的恶化和转变、癌细胞存活及生长、肿瘤侵袭和转移等生物特性。第二部分IL-1β对宫颈癌细胞HELA CCL2 mRAN水平的影响目的:IL-1β可诱导HELA释放CCL2/MCP-1,但CCL2/MCP-1释放量增多是来源于HELA细胞中原有CCL2/MCP-1蛋白的释放还是有新的合成不得而知。本部分实验用RT-PCR检测CCL2/MCP-1mRNA在不同时间段的的表达水平。从而判断出IL-1β诱导HELA释放CCL2/MCP-1是由细胞新合成的还是原有贮存在细胞内的。方法:1、宫颈癌细胞HELA的RNA提取同等数量的宫颈癌细胞HELA种在6孔板中,饥饿、加药处理,将纯化柱经氯仿、乙醇处理后转入一个新的EP管中,加32μl RNase-free ddH2O,在室温下放置2分后4℃12,000 rpm离心2min后弃纯化柱,此时在EP管中即为提取的总RNA。2、宫颈癌细胞HELA的RNA质量检测紫外吸收法读取EP管中RNA在分光光度计260nmol/L和280nmol/L处的吸收值,测定RNA溶液浓度和纯度。（1）浓度测定:A260下读值为1表示40μg RNA/ml。以公式:A260×稀释倍数×40μg/ml计算样品RNA浓度（μg/ml）。（2）纯度检测RNA溶液的A260/A280的比值即为RNA纯度,比值范围1.8-2.1。3、将RNA逆转录成cDNA以1μg RNA为模板,具体步骤依照天跟的逆转录试剂盒说明书操作,完成cDNA的逆转录。4、Real-Time PCR测定mRNA水平为了确定DNA模板的添加量的最佳浓度,必要之时可行梯度稀释。以避免DNA的不同种类模板中所含有的靶基因拷贝数不尽相同所导致的误差。确认Real Time PCR的扩增曲线和溶解曲线。应用荧光定量PCR仪（ABI7300）附带的7300 System SDS Software计算CCL2/MCP-1与18s mRNA水平的比值,即相对定量结果。结果:与对照组0h相比,IL-1β刺激HELA 1h后CCL2/MCP-1 mRNA表达水平开始增多,在4 h时增到最大值为0h对照组的4.5（P<0.001）。表明IL-1β可上调HELA细胞CCL2/MCP-1mRNA水平,从而推断出IL-1β诱导HELA细胞新合成CCL2/MCP-1并释放,而不是细胞内原有贮存的CCL2/MCP-1。小结:在IL-1β刺激之下人宫颈癌细胞HELA后,CCL2/MCP-1mRNA表达水平开始增加。不同浓度和相同浓度不同刺激时长能够诱导细胞内的CCL2/MCP-1合成显著增高,进而有利于促瘤炎症形成。肿瘤组织炎性微环境的逐步确立后,以IL-1为代表的炎症因子刺激而导致的CCL2/MCP-1诱导性表达将成为促进肿瘤细胞进一步合成分泌CCL2/MCP-1的主要机制。第三部分检测细胞HELA细胞的p-NF-κBp65蛋白表达水平变化目的:阐述NF-kB在宫颈癌的发生和发展中的作用。选择细胞核中p-NF-κBp65的蛋白表达水平作为NF-kB已被激活的标志。在本实验中研究IL-1β（10ng/ml）刺激HELA细胞后细胞核中p-NF-kBp65蛋白是否表达上调。进一步验证转录因子NF-kB（p65）参与了IL-1β诱导的人宫颈癌细胞HELA的进程中,我们使用IL-1β诱导HELA不同时间,提取胞浆与胞核蛋白,利用western-blot验证分析IL-1β是否诱导了转录因子NF-kB（p65）的表达,并且转录因子NF-kB（p65）是否在HELA细胞中出现核转位效应,在何时转位效应达到最大。方法:1、HELA细胞总蛋白提取宫颈癌细胞HELA经饥饿24h后,加药孵育,预冷灭菌的1×PBS洗涤2-3次,配蛋白裂解液RIPA加入,静置30min后超声裂蛋白,离心后收集上清液,该上清液即为所提取的细胞总蛋白。2、细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提（1）IL-1β按不同的时间梯度刺激经过24小时饥饿处理后宫颈癌细胞HELA。加入PMSF,PBS洗一遍按处理之后的HELA细胞,再加入添加了PMSF的细胞浆蛋白抽提试剂A。最高速剧烈Vortex 5秒,冰浴1后加入细胞浆蛋白抽提试剂B剧烈Vortex 5秒,吸取试管上清即为抽提得到的细胞浆蛋白。（2）完全吸尽残余的上清,收集上一步骤沉淀,50微升添加了PMSF的细胞核蛋白抽提试剂加入沉淀中。以最高速剧烈Vortex15-30秒,完全悬浮并分散细胞沉淀。然后放回冰浴中,每隔1-2分钟再高速剧烈Vortex 15-30秒,共30分钟。4oC 12,000-16,000g离心10分钟。立即吸取上清液即为抽提得到的细胞核蛋白。3、BCA法测定蛋白浓度,SDS-PAGE分离蛋白,然后暗室曝光。结果:我们发现IL-1β（10ng/ml）刺激HELA细胞,5min后p-NF-kBp65蛋白表达上调,在10min达到高潮,随后有所下降但仍较对照组0min时表达更多。而NF-kBp65总蛋白水平对IL-1β（10ng/ml）刺激无应答。随着IL-1β诱导时间增长,胞质中p-NF-kB（p65）在10min增加,30min达到顶峰,随后逐渐减少,而胞核中p-NF-kB（p65）在30min后出现增加,由此可以得出IL-1β诱导了转录因子NF-kB（p65）在HELA细胞的核转位效应,且在1h处转位效应达到最大。小结:IL-1β可使宫颈癌细胞HELA中的NF-kB磷酸化入核成为有活性的p-NF-kBp65。而且胞质、胞核中的p-NF-kB（p65）出现转位效应是随着IL-1β诱导时间的延长而愈加明显。因此可以得出转录因子NF-kB（p65）在HELA细胞的核转位效应是由IL-1β介导产生的,且在1小时处转位效应达到最大。第四部分TPCA-1（NF-kB阻断剂）对IL-1β诱导人宫颈鳞癌细胞分泌CCL2的影响目的:IL-1β可激活转录因子NF-kB,为了进一步确认是否NF-kB参与了IL-1β诱导的HELA细胞CCL-2/MCP-1的释放。用NF-kB抑制剂TPCA-1按不同浓度来阻断IL-1β通过刺激p-NF-kBp65/NF-kBp65后来观察CCL-2/MCP-1的表达情况。方法:人宫颈癌细胞HELA培养细胞同前。将细胞状态良好且生长至90%左右的细胞接种到96孔板,以无血清培养基DMEM饥饿处理24h。加入TPCA-1按不同浓度梯度预孵育HELA细胞半小时,实验组半小时后加入IL-1β（10ng/ml）共同孵育9小时,对照组仅TPCA-1继续孵育9小时,各个浓度均设相应对照。9小时后收集细胞培养上清液ELISA检测。结果:ELISA检测TPCA-1可阻断IL-1β诱导的HELA释放CCL-2/MCP-1,且呈现浓度依赖性。当TPCA-1浓度为1uM时已经可以阻断IL-1β诱导HELA CCL-2/MCP-1释放量的55%（P<0.05）,而浓度为10uM时,其阻断率已达80%（P<0.01）。用不同浓度的TPCA-1来阻断IL-1β诱导HELA表达CCL-2/MCP-1,实时荧光定量PCR检测阻断后的CCL-2/MCP-1 mRNA水平。结果当TPCA-1浓度为0.1uM就有明显的阻断效果;浓度增加到0.3uM时已经可以阻断IL-1β诱导HELA CCL-2/MCP-1 mRNA的50%（p<0.001）,而浓度为3uM时,其阻断率高达99%（****p<0.0001）。小结:NF-kB抑制剂TPCA-1可以通过阻断IL-1β对宫颈癌细胞HELA中p-NF-kBp65/NF-kBp65的表达,进而对CCL-2/MCP-1的表达产生抑制。而且与抑制剂TPCA-1的关系呈浓度依赖性。结论:IL-1β可以通过活化下游信号通路,介导下游细胞因子的合成。人宫颈癌细胞HELA在炎性因子IL-1β刺激下可产生CCL2/MCP-1表达。进一步使用RT-PCR检测CCL2/MCP-1 mRNA的表达水平证实CCL2/MCP-1释放量增多是来源于HELA细胞内新的CCL2/MCP-1合成,并且揭示出IL-1β正向调控人宫颈癌细胞表达CCL2/MCP-1呈时间依赖性和浓度依赖性。Western blot检测宫颈癌细胞HELA胞浆与胞核中的p-NF-kBp65蛋白表达变化情况。以及TPCA-1（NF-kB阻断剂）对IL-1β诱导人宫颈癌细胞分泌CCL2/MCP-1的影响,上述发现提示炎性因子IL-1β可通过NF-kB信号通路刺激人宫颈癌细胞HELA表达CCL2/MCP-1。而IL-1β对CCL2/MCP-1的所产生正向调控作用提示其可能成为促瘤炎症方面新的肿瘤治疗靶点。这为旨在揭示肿瘤微环境的新肿瘤治疗策略的制定以及肿瘤患者预后分析提供了实验依据。