手足口病是婴幼儿的一种常见传染病。EV71是引起患者手足口病的主要病原体之一,同时还能引起无菌性脑膜炎、脑干脑炎和脊髓灰质炎样麻痹等多种与神经系统相关的疾病,严重威胁了儿童的生命健康,预防EV71的流行十分重要。据统计,2009年我国共报告手足口病病例约115.5万例(不含港、澳、台),死亡病例353例,占我国丙类传染病发病数第一位。至今尚无有效的针对性的疫苗预防EV71的感染,只能提高监测的强度和灵敏度,早发现,早治疗。因此研制针对EV71的预防性疫苗对控制婴幼儿手足口病的流行具有十分重要的意义。本课题选择利用酿酒酵母表达系统发酵表达EV71 VLP。首先参照酿酒酵母基因中的优势密码子,运用分子生物学技术对EV71 P1和3CD基因进行设计和全基因合成。将合成的基因序列克隆到酿酒酵母表达载体上,转化酿酒酵母进行诱导表达。同时扩增EV71 VP1、VP2、VP3和VP4四个基因,克隆到酿酒酵母表达载体上,转化酿酒酵母进行诱导表达。其次,对诱导后的酵母细胞进行破碎,利用蛋白沉淀、氯化铯密度梯度离心等纯化方法初步纯化分离VLP。对纯化后样品进行Western Blot检测鉴定;并通过负染电镜观察VLP。本课题利用两种方法在酿酒酵母中表达EV71 VLP:1.将VP1、VP2、VP3和VP4四个基因共同转化酵母细胞,可以在酿酒酵母细胞中表达,并自行组装成VLP。2. P1和3CD蛋白可以在酿酒酵母中成功表达,蛋白酶3CD将P1蛋白切割成VP1、VP2、VP3和VP4,后者在酿酒酵母中自行组装成VLP。实验中初步纯化的VLP可作为EV71预防性疫苗进行下一步研究。