microRNA(mi RNA)是18-25个核苷酸(nt)的单链RNA分子[1]，其通过碱基的完全或不完全互补，可与靶标基因的mRNA序列3’非编码区结合，从而使靶标的mRNA降解或翻译抑制[2]。miRNA的成熟包括三个过程:①具茎环结构的原初转录本(初级前体，pri-miRNA,500-3000nt)[3];②经内切核酸酶（Drosha酶）剪切为具发夹结构的次级转录本次级前体，pre-miRNA(60nt)[4];③经内切核酸酶（Dicer酶）剪切为成熟的单链miRNA(18-23nt)[5]。let-7是继lin-4之后，第二个被鉴定出的miRNA。let-7家族成员中研究最多、较为重要的是let-Ta，其以往被认为是肿瘤抑制者，多篇文献报道其在胃癌中低表达[6-8]。在生物体精细的调控网络下，let-7家族因其能调控miRNA形成过程中的两大重要的切割酶（Drosha和Dicer）而拥有异常重要的功能[9]。虽然let-Ta甚至let-7基因家族已被研究得较为透彻，但这些研究都是围绕着let-7a本身的生物学功能及致病作用展开的。然而，基因是存在多态性的，也正是由于基因单核苷酸多态(Single nucleotide polymorphism， SNP)的存在，可以导致相同基因编码产物的功能不同。　　 研究发现，let-Ta的编码基因有三，包括let-Ta-1、let-7a-2和let-7a-3，三种let-7a基因均能转录出miRNA成熟体——let-Ta。let-7a的前体位置上是存在多态性的，且其多态位点在中国人群中存在一定的频率分布，最小等位基因频率(MAF)＞5％。miRNA前体位置上的多态可以作为疾病风险预警的标志物已越来越多的为学者们所认同，例如pri-miR-218 rs11134527与中国人群的肝癌发病风险有关[10]，pre-mir-146a rs2910164、pre-mir-27a rs895819、pre-miR-196a2rs11614913、 pre-mir-149 rs2292832、 pre-mir-499 rs3746444[11-17]、pri-miR-938 rs2505901[18]与胃癌的发病风险有关。而目前，miRNA多态的研究现状是，成熟miRNA功能研究较多，但其多态性研究较少;成熟miRNA已鉴定出2042个，但其前体区SNP者少，加之在人群中存在MAF＞5％者更少，约仅占已鉴定出miRNA总数的5％[19]，而学者们多研究最先发现的几个阳性SNP，大量与疾病关系未知的miRNA多态尚有待于研究。我们采用NCBI生物信息学数据库，在其初级前体区(±600bp)筛选具有代表性的标签SNP(tagSNP)，仅查找到3个tagSNP位点(分别是pri-let-7a-2 rs629367和 rsi143770， pri-let-7a-1rs10739971)。通过相关文献检索发现，仅有少量涉及精神分裂疾病[20]、非小细胞肺癌[21]等疾病的多位点筛查研究中提及上述多态位点，但其是否可以作为疾病风险预警的标志物，特别是与肿瘤的相关性，还尚未见报道。因此，上述三个pri-let-7a的tagSNP位点在中国人群与胃癌及癌前疾病是否相关，其是否可以作为胃癌的高风险预警标志，如果相关其调控机制如何，这些都无人报道且有待于研究。　　 胃癌是多基因、多因素共同作用的结果，多项研究显示基因-环境间以及SNP-SNP间的交互作用对于致癌可能具有联合的效应[22-25]。因此，pri-let-7a多态与幽门螺杆菌感染（H.pylori，HP）、吸烟、饮酒等环境因素，与其他基因多态之间是否存在交互作用，尚有待探讨。　　 综上，本研究通过开展以中国北方人群为基础的病例-对照研究，采取“初筛-扩大病例验证”的两步法策略，检测胃癌及癌前疾病患者三种pri-let-7a多态，以明确其与胃癌及癌前疾病发病风险的关系;进一步检测两者共同的成熟miRNA在对照组-萎缩性胃炎-胃癌(CON-AG-GC)疾病链患者的血清中，及在胃癌患者的癌组织-断端对照中的表达情况，以探讨不同let-7a多态对其成熟体表达的影响;同时，通过体外实验转染与疾病发病风险相关的不同pri-let-7a多态的表达质粒，检测细胞中let-7a成熟体的表达情况，以进一步探讨let-Ta多态调控其成熟体表达的作用。　　 本研究期望通过寻找与胃癌及癌前疾病发病风险密切相关的miRNA多态，为胃癌的早期诊断及发病机制的探讨提供实验依据。　　 方法：　　 1、根据NCBI dbSNP和HapMap数据库公布的最新数据，结合文献选择pri-let-7a多态在中国人群SNP最小基因频率MAF≥5％的tagSNP进行研究。　　 2.本研究采用筛选-验证研究模式，首先在107GC患者，以及配比的107 AG患者，124对照者中采用PCR-RFLP及测序法检测经软件及文献预测出的三种miR多态(pri-let-7a-2 rs629367 and rs1143770,pri-let-7a-1 rs10739971)。进一步采用Sequenom MassARRAY高通量技术平台(Sequenom Inc.，San Diego，CA)，在另一组完全独立的样本中，检测了472例胃癌，649例萎缩、721例对照者的两个tagSNPs，即:pri-let-7a-2 rs629367，pri-let-Ta-1 rs10739971，对于该技术平台未能成功分型，以及为研究表达水平新收集的胃癌病例107例，采用测序的方法分型。利用SPSS13.0软件进行统计分析。以X2检验进行Hardy-Weinberg平衡性检验，以比值比(Odds ratio，OR)95％可信区间(Confidential interval，CI)表示各基因型发生不同胃疾病的风险度，采用多因素Logistic回归分析法计算OR值，P＜0.05表示有统计学意义。　　 3、采用酶联免疫吸附(ELISA)法检测血清H.pylor-IgG抗体含量。H.pylor-IgG抗体滴度≥34EIU为H.pylori阳性。采用问卷调查及病例查询法记录病例吸烟及饮酒资料。经性别、年龄、H.pylorig感染情况进行调整，采用全因子模型计算基因分型与H.pylorig感染、吸烟及饮酒的交互作用总P值。　　 4、提取血清及组织中的总miRNA，反转后进行成熟let-7a的Real-time PCR定量检测。　　 5、构建pCMV-MIR-rs629367C及其突变体pCMV-MIR-rs629367A表达质粒，比较pri-let-7a-2 rs629367 A＞C不同等位基因型的let-7a成熟体的表达情况。　　 6、在Sequenom MassARRAY技术平台的共有数据中，分析let-7a多态与其预测靶基因ERCC6多态的交互作用，采用全因子模型计算基因-基因交互作用总P值。　　 结果：　　 1.对pri-let-7a三个多态位点进行基因分型，pri-let-7a-2 rs629367和rs1143770，pri-let-7a-1 rs10739971三个多态位点在对照组基因型频率分布符合Hard-Weinberg遗传平衡。　　 2.pri-let-7a-2 rs629367多态CC变异基因型提高了胃癌及萎缩性胃炎的发病风险达1.826倍和1.861倍(分别为P=0.048，95％CI=1.004-3.319;P=-0.032，95％CI=1.055-3.281)，且在H.pylori抗体阴性的患者中，此效应更高达2.117倍和1.969倍(分别为95％CI=1.082-4.143;95％CI=1.028-3.772)，但该多态位点与H.pylori感染未见交互作用，无论在萎缩性胃炎组中还是胃癌组中（分别为P=0.786和P=0.382）。该多态与其他环境因素——吸烟、饮酒未见交互作用。　　 3.分析pri-let-7a多态对其成熟体表达的影响，发现在萎缩性胃炎组中，let-7a2 rs629367多态AA、CA、CC基因型携带者血清let-7a表达水平依次升高(对数值为3.30±0.56 Vs.3.52±0.55 Vs.3.76±0.34)，差别有统计学意义P=0.043)。　　 4.不同等位基因的表达质粒转染胃癌细胞系SGC-7901后，72小时的let-7a表达水平存在统计学差异（P＜0.001）。突变型C等位基因较野生型A等位基因的let-7a表达水平明显增高(4.14±0.32 Vs.2.75±0.05)。　　 5.pri-let-7a-1 rs10739971与ERCC6 rs1917799存在SNP-SNP间的交互作用。携带突变型AA-GG（rs10739971-rs1917799）的个体与非携带AA-GG(rs10739971-rs1917799)的个体相比，罹患胃癌的风险增大到2.572倍(Pinteraction=0.027,95％CI为1.114-5.938)。　　 结论：　　 1、pri-let-7a-2 rs629367多态CC变异基因型提高了胃癌和萎缩性胃炎的发病风险，与H.pylori感染、吸烟、饮酒等环境因素未见交互作用。　　 2、体内体外实验均提示，pri-let-7a-2 rs629367多态CC变异基因型可以提高成熟let-Ta的表达水平，其可能是CC变异基因型提高胃癌及萎缩性胃炎发病风险的原因之一。　　 3.pri-let-7a-1 rs10739971多态与ERCC6 rs1917799多态存在交互作用。携带突变型AA-GG（rs10739971-rs1917799）的个体与非携带AA-GG（rs10739971-rsl917799）的个体相比，罹患胃癌的风险增高。