Duchenne型肌营养不良症(Duchenne Muscular Dystrophy,DMD)是一种常见的X染色体连锁隐性遗传病，最早由法国神经病学家Duchenne de Boulogne于1868年描述，后人为了纪念他将该病命名为DMD，Gowers更详细地描述了该病，为了纪念他，将DMD的典型表现命名为Gowers征。DMD发病率约为，每3500个男婴中有一个患该病，女性携带者的携带频率为1/2300，是最常见的遗传性神经肌肉疾病之一。该病的主要特征是：进行性的四肢近端骨骼肌萎缩并且无力，小腿腓肠肌假性肥大，并且及心肌和呼吸肌也有严重病变，心衰和呼吸衰竭常常是致死原因。　　 目前对DMD仍无有效的治疗办法，研究主要集中在药物治疗、基因治疗和细胞治疗。药物治疗只能作用于DMD病理生理的特定环节，暂时缓解但无法阻止病情进展。基因治疗是向靶细胞引入正常有功能的基因以纠正或补偿致病基因所产生的缺陷，从而达到治疗目的，但也存在表达效率低、分布局限、载体容量不足以携带全长dystrophin基因、具有生物毒性等缺陷而致应用困难。DMD细胞治疗包括成肌细胞和干细胞移植治疗，成肌细胞移植采用局部注射，治疗部位局限，不能治疗心肌与膈肌损害，且dystrophin表达时间短，这些问题阻碍了成肌细胞移植的临床应用；干细胞因携带人体正常的基因组，具有成肌分化潜能，是细胞移植治疗DMD较为理想的选择。　　 目的：将decorin转染给ADSCs，将细胞治疗和抑制myostatin相结合，体内外观察decorin抑制myostatin后的成肌率变化并研究其机制，并检测肌酶，肌力以及肌肉病理的变化，从而为ADSCs移植和抑制myostatin的作用结合起来治疗DMD提供理论基础。　　 方法：　　 ⑴7只雌性SD大鼠(4-6 week)用来进行ADSCs的培养.在体内试验，我们选用了34只mdx鼠(8-9 week)，随机分成3组：(1)未治疗组(mdx组)：经放疗但未治疗的mdx小鼠10只(2)GFP-ADSCs细胞移植治疗组(GFP-ADSCs组)：7-9周鼠龄的mdx鼠(12只)进行GFP-ADSCs细胞尾静脉移植(3)DCN-ADSCs细胞移植治疗组(DCN-ADSCs组)：7-9周鼠龄的mdx鼠(12只)进行DCN-ADSCs细胞尾静脉移植。10只C57BL/C鼠做为对照。在细胞移植后20周，在运动功能检测后处死动物进行HE染色，免疫荧光检测，Western Blot检测。　　 ⑵应用DMEM培养4-6周雌性SD大鼠脂肪干细胞，按1×109/L密度接种于T-25培养瓶中，置37℃、体积分数为5％的CO2、饱和湿度的培养箱内培养。48小时后换液一次，弃去未贴壁细胞，以后每3～4天换液1次。　　 ⑶用重组慢病毒液在不同条件下对ADSCs进行转染，流式细胞仪检测转染效率并探讨其转染的最佳条件。得出慢病毒转染的最佳MOI(multiplicity ofinfection)。在最佳MOI值下，用含GFP的慢病毒和含GFP/DCN融合蛋白的慢病毒对ADSCs进行转染，得到含GFP的ADSCs(以下简称GFP-ADSCs或者GFP细胞)和含GFP和DCN融合蛋白的ADSCs(以下简称DCN-ADSCs或者DCN细胞)。　　 ⑷未转染的大鼠ADSCs、GFP-ADSCs和DCN-ADSCs经5-氮胞苷诱导分化24小时后，改为含5％HS的DMEM诱导培养基继续培养3天、7天、14天。分别用免疫荧光和Western blot检测各个时间段相对应的MyoD、Myogenin和MHC的表达情况。对以上细胞进行成脂诱导，16天后，光镜和油红O染色观察成脂情况。　　 ⑸比较移植前和移植后20周mdx鼠的体重。移植后20周，分别解剖不同组的鼠，比较不同组鼠的腓肠肌，股直肌及胫前肌的重量。　　 ⑹各组实验鼠的腓肠肌组织整个取出，放入已经用液氮冷冻的异戊烷3-5秒后，放入细胞冻存管后，浸入液氮中保存。OCT包埋，冰冻切片机切成5-6μm厚切片，做HE染色，镜下观察骨骼肌细胞的形态及变性坏死情况，肌纤维的粗细，核中心移位纤维(centrally nucleated fiber，CNF)比例等情况。　　 ⑺应用SPSS13.0分析软件进行统计分析。资料的所有数值以均数±标准差表示。组间比较用方差分析，多组间显著性差异比较采用F检验，两两比较采用Student-Neuls(S-N-K)检验和LSD检验。双侧检验，显著性检验水准为α=0.05。　　 结果：　　 ①大鼠ADSCs表面标志抗原的表达：不表达成纤维细胞标志物CD34，而表达整合素家族类抗原标志分子CD29和黏附分子家族类抗原标志分子CD44及CD13。　　 ②ADSCs经成骨诱导液诱导后14天检测可见橘红色的钙结节，为茜素红S与钙盐形成的橘红色复合物，对照组结果为阴性。　　 ③ADSCs经成脂诱导液诱导16天后，检测有脂肪形成，细胞中含大小不等的脂肪滴，细胞核被脂滴挤于细胞一侧，对照组为阴性。　　 ④MyoD是在成肌过程中早期表达的成肌因子。表达主要在细胞核。GFP-ADSCs和DCN-ADSCs经过5-氮胞苷诱导分化后3天，进行免疫荧光染色。结果发现在GFP-ADSCs组中有平均9.8％的细胞胞核MyoD表达阳性，呈明亮的红色荧光，而DCN-ADSCs组，MyoD阳性表达明显增加，达到34.7％。Western Blot结果示：MyoD的表达在GFP-ADSCs组较少，而在DCN-ADSCs组其表达量明显增加，与免疫细胞化学的结果基本一致。　　 ⑤MHC是成肌晚期的标志物，肌管中的特异性标志蛋白，表明肌管已经完全分化成熟。主要表达于新生肌管的胞浆中。ADSCs经过5-氮胞苷诱导分化14天后，进行免疫荧光染色，阳性细胞的胞浆呈红色。结果发现GFP-ADSCs组中有平均4.2％的细胞胞核融合于MHC表达阳性的肌纤维中，而在DCN-ADSCs组中，达到8.6％。Western Blot结果示MHC的表达在GFP-ADSCs组较少，而在DCN-ADSCs组表达量明显增加，与免疫细胞化学的结果基本一致。　　 ⑥Mdx鼠由于肌膜缺乏dystrophin表达，肌细胞会出现大量变性坏死，我们对移正常C57鼠、未治疗mdx鼠及移植细胞后20周的各组mdx鼠的腓肠肌进行冰冻切片。正常C57鼠的腓肠肌横切面可以观察到肌细胞得大小和形态基本一致，肌细胞呈典型的多边形，未见明显肌萎缩和坏死。肌细胞核位于肌膜附近，在肌纤维间隙，几乎没有观察到CNF，肌细胞间质未见炎细胞；肌纤维间隙正常，几乎无纤维化，结构完整。而在未治疗的mdx鼠腓肠肌中，可见大量的炎细胞，肌细胞因萎缩变成圆形，肌细胞间间隙变宽，细胞大小不均，可见有新生肌纤维，其形状较小。CNF现象严重，细胞间隙可见明显纤维化。GFP-ADSCs组20周后可见肌组织内炎性细胞浸润减轻，细胞大小趋向统一，核中心移位现象减少，纤维化有所减轻。而DCN-ADSCs组mdx鼠炎性细胞浸润、核中心移位现象进一步减少。另外DCN-ADSCs组mdx鼠肌纤维有增粗。　　 ⑦对移植后20周的各个实验组进行myostatin，decorin的western blot的检测。可见，在mdx鼠myostatin表达最多，GFP-ADSCs组mdx鼠的myostatin有所下降，DCN-ADSCs组mdx鼠下降最明显。而decorin的表达正好相反，mdx鼠表达最小，GFP-ADSCs组mdx鼠的decorin表达有所上升，而DCN-ADSCs组mdx鼠上升最明显。Myostatin和decorin的表达是完全相反的。　　 ⑧应用兔抗DYS抗体标记的IgG进行免疫荧光染色，结果发现，对照组C57鼠腓肠肌肌膜呈完整的网状红色荧光，mdx鼠肌膜基本未见红色荧光；GFP-ADSCs组mdx鼠，20周后肌膜DYS阳性纤维数大约占细胞总数的5.4％，部分肌膜DYS染色不连续，而在DCN-ADSCs组mdx鼠，DYS阳性纤维数大约占细胞总数的7.9％。　　 结论：　　 ⑴携带GFP和DCN的慢病毒载体可以有效转染大鼠ADSCs，并可以持久表达绿色荧光。　　 ⑵用5-氮胞苷诱导ADSCs成肌分化时，DCN-ADSCs成肌率较GFP-ADSCs高，而成脂率低，证明decorin可以抑制myostatin对细胞成肌的抑制作用，促进ADSCs在体外向肌细胞的分化，同时抑制细胞向脂肪转化。以上促进成肌的作用可能是通过提高myoD和myogenin表达实现的。　　 ⑶在用ADSCs尾静脉移植治疗mdx鼠时，decorin中和mdx鼠体内产生的内源性myostatin后，可以降低肌酶的水平，使肌肉明显肥大，肌力提高。并且可以改善mdx鼠的病理变化，促进ADSCs移植后在体内向骨骼肌细胞的分化率，并更多的表达dystrophin蛋白。　　 ⑷应用DCN-ADSCs和GFP-ADSCs移植给mdx后，没有观察到除骨骼肌外的其它组织器官的异常改变，说明了该治疗方法的安全性。