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受体相关蛋白(Receptor associated protein,RAP)在细胞内质网中表达,它可以和多种蛋白结合,其中包括低密度脂蛋白受体相关蛋白(low density lipoproteinreceptor-related protein,LRP1)、脂蛋白脂酶(lipoprotein lipase,LPL)、极低密度脂蛋白受体(very low density lipoprotein receptor,VLDLR)和糖蛋白330(glycoprotein 330/megalin)。相关的研究表明,RAP可以在上述蛋白合成分泌过程中,与这些蛋白的前体结合,预防其在蛋白成熟前与其它细胞内蛋白结合。RAP基因的缺失可能导致上述蛋白表达减低。因此,RAP也被称为相关蛋白的分子伴侣。和RAP相关的蛋白中,LRP1具有对血管疾病的保护作用,如LRP1在血管平滑肌细胞、巨噬细胞和肝细胞中的表达缺失可以促进动脉粥样硬化的发生;而LPL在巨噬细胞中表达缺失却可以减少动脉粥样硬化的发生。尽管上述蛋白,尤其是LRP1,在心血管疾病中的作用已经做了广泛深入的研究,但关于RAP在心血管疾病中作用的研究,目前仍然是一片空白。本课题将采用RAP基因敲除小鼠,探讨RAP在血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱导的动脉粥样硬化和腹主动脉瘤(AAAs)中的作用。RAP基因敲除小鼠购买自Jackson实验室。所有实验小鼠均和C57BL6小鼠杂交繁殖10次以上。通过渗透性微泵慢性持续输注AngⅡ28天,诱导动脉粥样硬化和腹主动脉瘤病变的发生。血浆胆固醇浓度和脂蛋白的分布通过酶反应试剂盒和快速蛋白液相法(Fast Protein Liquid Chromatography,FPLC)检测。Kent 8尾动脉测压系统测量小鼠尾动脉收缩压。显微镜直视下,通过测量主动脉弓内膜表面动脉粥样硬化病变面积来量化动脉粥样硬化(en face measurement)。采用Image-Pro软件量取腹主动脉肾动脉以上段最大的外径作为AAAs的评估指标。动脉外径大于正常值(约0.8mm)50%,定义为AAAs。首先,鼠系和年龄相当的雄性小鼠(RAP+/+,n=11,RAP-/-,n=10)予以常规饲料喂养,并通过渗透性微泵输注AngⅡ(1000ng/kg/min)28天。结果表明,RAP基因敲除并不影响小鼠的体重和血总胆固醇水平。AngⅡ输注同时增加两组小鼠尾动脉收缩压(RAP+/+,177±7mmHg,RAP-/-,170±5mmHg,P=NS)。RAP基因敲除不增加AngⅡ诱导的AAAs的发生。然后,鼠系和年龄相当的LDL受体基因敲除的雄性小鼠,同时分别是RAP+/+(n=20)或RAP-/-(n=17)小鼠予以高脂饮食。我们观察高脂血症时,小鼠动脉粥样硬化和AAAs的变化。所有小鼠输注500 ng/kg/min的AngⅡ28天。结果表明,实验过程中两组小鼠没有明显的体重差别。AngⅡ输注均升高两组小鼠的尾动脉收缩压(RAP +/+:171±6mmHg;RAP -/-:165±5 mmHg;P=NS)。在LDL受体基因敲除的背景下,RAP基因敲除显著升高血浆胆固醇浓度(RAP +/+:1122±40;RAP -/-:1500±56 mg/dl;P＜0.001)。FPLC和非线性拟合分析表明,RAP基因缺失导致了VLDL(RAP +/+:484±22;RAP -/-:713±55 mg/dl;P=0.001)和IDL/LDL(RAP +/+:566±25;RAP -/-:757±42 mg/dl;P＜0.001)浓度的显著升高,与此同时,降低了HDL(RAP +/+:75±3;RAP -/-:63±4 mg/dl;P=0.028)的浓度。尽管RAP基因敲除引起了上述致动脉粥样硬化性血脂成分改变,RAP基因敲除小鼠主动脉弓的动脉粥样硬化病变面积百分比,与RAP+/+小鼠相比,却显著降低(RAP +/+:18.28±2.24%;RAP -/-:11.74±0.99 mg/dl;P=0.041)。而两组小鼠腹主动脉外径没有显著差异(1.48±0.30 versus 1.25±0.15 mm,P=NS)。为区分是骨髓来源的细胞(主要是巨噬细胞)还是血管壁中的原有的细胞(resident细胞,如血管平滑肌细胞,内皮细胞)中的RAP基因,发挥的对动脉粥样硬化和动脉瘤的调控作用,我们进行骨髓移植实验。LDLR基因敲除小鼠以非致死剂量进行骨髓照射后,予以RAP+/+(n=24)或RAP-/-(n=25)骨髓细胞进行骨髓重建4周。骨髓重建后小鼠予高脂喂养并输注500 ng/kg/min AngⅡ28天。实验结果表明,骨髓来源的细胞特异性RAP基因缺失对小鼠的体重和血浆胆固醇没有显著影响。AngⅡ同时升高两组小鼠尾动脉收缩压(RAP +/+:168±3 mmHg;RAP -/-:173±3 mmHg;P=NS)。骨髓来源的细胞特异性RAP基因敲除并不降低小鼠主动脉弓动脉粥样硬化面积百分比(RAP +/+:24.07±2.14%;RAP -/-:19.24±2.21 mg/dl;P=0.124)。但是骨髓来源的细胞特异性RAP基因敲除却导致了腹主动脉直径的显著升高(RAP+/+:0.99±0.04mm;RAP-/-:1.28±0.12mm,P=0.01),并增加AAAs的发生率(RAP+/+:4%;RAP-/-:41%,P=0.001)。最后,我们通过体外实验,检测RAP,作为LRP1的伴侣蛋白,对LRP1表达的调控作用。Western blotting显示,RAP基因敲除完全阻断成熟的LRP1蛋白在巨噬细胞中的表达。RAP基因敲除对血管平滑肌细胞中LPR1的表达没有影响。免疫染色显示,RAP基因缺失降低了LRP1在肝脏细胞中的表达。通过上述实验,我们认为:1.RAP细胞依赖性的调节LRP1的表达;2.Resident细胞中的RAP,通过独立于LRP1的方式,促进动脉粥样硬化的发生;3.骨髓来源细胞中的RAP保护AngⅡ诱导的AAAs发生,但该作用需进一步研究证明。我们的实验结果具有如下的意义:1.RAP调控LRP1的表达是细胞依赖性的,从而加深和丰富了人们对分子伴侣调控目标蛋白表达的认识。2.通过严格的动物实验,首次阐明了RAP基因在动脉粥样硬化中的作用。3.该结果支持动脉粥样硬化和动脉瘤是两种不同的血管疾病,具有不同的致病机制的观点。