论文部分内容阅读
研究背景动脉粥样硬化是一种全身动脉血管性疾病，临床上常表现为心肌梗死、脑卒中、主动脉瘤、主动脉夹层及下肢间歇性跛行等，有极高的致残率和致死率，是危害人类健康的主要疾病。但是，动脉粥样硬化的病因尚未完全确定，治疗效果还不满意，因此探讨动脉粥样硬化的发生机制和寻找有效的治疗方法具有十分重要的意义。血管内皮生长因子（VEGF）具有多种生物学活性，如促进血管内皮细胞增殖和血管新生、促进多种血管活性物质合成、促进血管舒张、抑制血栓形成、抑制血管平滑肌细胞增殖等，其中促进血管内皮细胞增殖作用具有高度特异性。在动脉粥样硬化中，一方面VEGF具有刺激一氧化氮和前列环素2产生，增强内皮完整性，抑制血管平滑肌细胞增殖，增加内皮抗血栓等血管保护作用；另一方面VEGF可能加速动脉粥样硬化斑块进程，加重血管损害。所以，进一步了解VEGF生物学作用的确切机制在防治粥样硬化方面具有重要意义。在动脉粥样硬化中血栓形成是重要危害因素，血管内血栓形成导致器官组织坏死，是导致我国居民死亡的首要原因之一。组织因子途径抑制物（TFPI）是体内极为重要的天然抗凝物质，内皮是其合成、储存和降解的场所。文献表明：急性心肌梗塞患者血浆中TFPI的浓度明显升高，缺血性心脏病、血脂异常、糖尿病等患者血浆中TFPI的浓度也有明显升高，在病情好转过程中，TFPI进行性下降。研究发现溶栓失败患者TFPI表达下降，考虑溶栓失败与TFPI的降低有关，犬血栓模型实验证实联合应用TFPI与tPA后，溶栓疗效明显提高。另有动物实验表明：在血管壁进行TFPI基因转移可防止局部血栓形成。文献显示：动脉粥样硬化病变中VEGF与TFPI呈同相改变，且密切相关，但其相互作用机制并不清楚。本实验设想通过调节VEGF基因观察TFPI的变化，进一步探讨二者的关系，寻找同相调节二者的方法，达到既稳定血管内皮又抑制血栓形成的作用，以达到更有效治疗动脉粥样硬化目的。骨髓间质干细胞是一种具有高度增殖和分化能力的成体干细胞。近年来发现骨髓间质干细胞在特定的条件下还可以向血管内皮细胞分化。骨髓间质干细胞不仅具有干细胞的共性，而且具有来源丰富、无免疫排斥、无年龄限制、无伦理学争议，能够转染和长期表达外源性基因。本实验选择骨髓间质干细胞为工程细胞。RNA干扰是目前最有效的基因沉默技术，能特异性抑制靶基因的转录，进而下调相应蛋白质水平及功能，它能快速而准确敲除特定基因。许多研究在动物疾病模型或培养细胞中，利用该项技术阻断相关基因的表达。本研究通过转染VEGF和沉默VEGF观察TFPI变化，初步了解二者的相互关系，探索以骨髓间质干细胞为工具的基因治疗，寻找新的有效的动脉粥样硬化治疗方法。一、载体的构建目的构建pcDNA3．1（-）VEGF真核表达载体；构建针对VEGF的发卡样siRNA真核表达载体pU-VEGF-siRNA，为进一步研究其对动脉粥样硬化的作用奠定基础。方法应用DNA重组方法，将编码VEGF cDNA定向克隆于真核表达载体pcDNA3．1（-）中，构建pcDNA3．1（-）VEGF真核表达质粒，通过酶切及测序鉴定；合成一对互补并编码相应短发夹状VEGF-siRNA的寡核苷酸链，将其插入到pSilencerTM2．1-U6 neo载体中，经测序鉴定所构建的重组载体是否正确。结果酶切结果与相应的载体和基因相同，对pcDNA3．1（-）VEGF进行测序，结果表明VEGF已正确克隆到pcDNA3．1（-）质粒；测序示pU-VEGF-siRNA序列正确。结论pcDNA3．1（-）VEGF、pU-VEGF-siRNA真核表达载体构建成功。二、VEGF对人骨髓间质干细胞TFPI的影响目的建立骨髓间质干细胞分离、培养的方法，观察其生物学特性，对分离、培养的骨髓间质干细胞进行鉴定；观察真核表达载体pcDNA3．1（-）VEGF、pU-VEGF-siRNA转染骨髓间质干细胞后VEGF、TFPI mRNA表达的变化及VEGF、TFPI蛋白质水平的变化。方法1．抽取幼儿骨髓，Percoll溶液密度梯度离心法分离后，将细胞重悬在人的骨髓间质干细胞培养基中培养，检测其生物学特性及多向分化潜能。2．脂质体介导pcDNA3．1（-）VEGF质粒转染体外培养的骨髓间质干细胞，荧光显微镜观察转染效果，RT-PCR方法检测转染后骨髓间质干细胞VEGF、TFPI mRNA表达水平，免疫印迹法半定量检测转染后骨髓间质干细胞VEGF、TFPI蛋白质水平，MTT法检测转染后骨髓间质干细胞培养上清液VEGF的生物学活性；3．脂质体介导pU-VEGF-siRNA质粒转染体外培养的骨髓间质干细胞，荧光显微镜观察转染效果，RT-PCR方法检测转染后骨髓间质干细胞VEGF、TFPI mRNA表达水平，免疫印迹法半定量检测转染后骨髓间质干细胞VEGF、TFPI蛋白质水平。结果1．骨髓间质干细胞的生物学特性：原代细胞接种后，72小时首次换液，细胞贴壁后胞浆充盈，外观呈梭形，7天后可见形状均一的细胞组成的集合，即为骨髓间质干细胞集落。骨髓间质干细胞生长到亚融合状态时，进行传代培养，传至第5代，骨髓间质干细胞被纯化，多次传代后的细胞呈均匀有序的成纤维样细胞；不同的换液时间对原代骨髓间质干细胞的生长影响差异无统计学意义；不同代骨髓间质干细胞生长曲线基本相同，3天进入对数生长期，6天达高峰，以后进入平台期；不同代骨髓间质干细胞贴壁率相似，随时间推移增高，增高速度先快后慢；骨髓间质干细胞增殖活性在一定的范围内随着血清浓度的增加而增大，当血清浓度超过20％时，细胞增殖活性不再增高；骨髓间质干细胞增殖活性在一定种植密度范围内随种植细胞数量增加而增高，在种植细胞密度为10×104／ml时，增殖活性最高；2．所培养的骨髓间质干细胞在特定的培养条件下具有向脂肪细胞、软骨细胞、成骨细胞分化的能力，符合判断骨髓间质干细胞的金标准。3．荧光显微镜示脂质体介导质粒转染体外培养的骨髓间质干细胞成功，效率较高；与对照组相比，VEGF、TFPI mRNA表达水平在pcDNA3．1（-）VEGF转染组显著增高，pU-VEGF-siRNA转染组显著降低，空载体转染组无明显变化；4．与对照组相比，VEGF、TFPI蛋白质水平在pcDNA3．1（-）VEGF转染组显著增高，pU-VEGF-siRNA转染组显著降低，空载体转染组无明显变化；与未转染质粒组相比，转染pcDNA3．1（-）VEGF真核表达载体的骨髓间质干细胞培养上清液的内皮细胞组λ480处的吸光值明显增高，转染空载体质粒、PU-VEGF-siRNA质粒组无变化。结论1．所分离、培养的骨髓间质干细胞是纯的、可长期传代、扩增、稳定的骨髓间质干细胞。2．转染VEGF基因可提高骨髓间质干细胞VEGF、TFPI mRNA表达水平，上调其VEGF、TFPI蛋白质水平；3．转染VEGF-siRNA基因可降低骨髓间质干细胞VEGF、TFPImRNA表达水平，下调其VEGF、TFPI蛋白质水平。4．VEGF基因转染骨髓间质干细胞后，其培养上清液具有较强的促内皮细胞增生作用。三、VEGF对SD大鼠主动脉组织TFPI的影响目的建立SD大鼠动脉粥样硬化模型；观察尾静脉注射转基因骨髓间质干细胞对SD大鼠主动脉组织VEGF、TFPI mRNA表达的变化及其VEGF、TFPI蛋白质水平的变化。方法1．66只雄性SD大鼠随机分为6组，每组11只，分别为A、B、C、D、E、F组，A组喂养普通饲料，B、C、D、E、F组喂养动脉粥样硬化饲料。超声及病理检查升主动脉、主动脉弓、降主动脉、腹主动脉。2．SD大鼠造模型成功后，经尾静脉向大鼠体内注入不同无血清培养基，每只鼠注射1ml，其中含骨髓间质干细胞的培养基中细胞密度为6×107／ml；A组不含任何成分的无血清培养基，B组不含任何成分的无血清培养基，C组含未经任何干预的骨髓间质干细胞，D组含转染空载体质粒的骨髓间质干细胞，E组含转染pcDNA3．1（-）VEGF质粒的骨髓间质干细胞，F组含转染pU-VEGF-siRNA质粒的骨髓间质干细胞。3．饲养一周后超声及病理检查升主动脉、主动脉弓、降主动脉、腹主动脉，RT-PCR方法检测主动脉组织VEGF、TFPI mRNA表达水平，免疫印迹法半定量检测主动脉组织VEGF、TFPI蛋白质水平。结果1．对照组SD大鼠主动脉未出现病变，动脉粥样硬化组大鼠3月后超声及病理可以检测到主动脉动脉粥样硬化斑块。2．经尾静脉注射骨髓间质干细胞后超声及病理可以检测到动脉粥样硬化斑块较前无明显变化。3．与正常鼠相比，主动脉组织VEGF、TFPI mRNA表达水平在注射转染pcDNA3．1（-）VEGF基因骨髓间质干细胞模型鼠组显著增高，注射转染pU-VEGF-siRNA基因骨髓间质干细胞模型鼠组显著降低，未注射骨髓间质干细胞模型鼠组、注射正常骨髓间质干细胞模型鼠组、注射转染空载体骨髓间质干细胞模型鼠组无明显变化。4．与正常鼠相比，主动脉组织VEGF、TFPI蛋白质水平在注射转染pcDNA3．1（-）WOF基因骨髓间质干细胞模型鼠组显著增高，注射转染pU-VEGF-siRNA基因骨髓间质干细胞模型鼠组显著降低，未注射骨髓间质干细胞模型鼠组、注射正常骨髓间质干细胞模型鼠组、注射转染空载体骨髓间质干细胞模型鼠组无明显变化。结论1．成功建立SD大鼠动脉粥样硬化模型。2．骨髓间质干细胞对模型鼠主动脉组织VEGF、TFPI mRNA表达水平，VEGF、TFPI蛋白质水平无影响；3．转染VEGF基因的骨髓间质干细胞可提高模型鼠主动脉组织VEGF、TFPI mRNA表达水平，上调其VEGF、TFPI蛋白质水平；4．转染VEGF-siRNA基因的骨髓间质干细胞可降低模型鼠主动脉组织VEGF、TFPI mRNA表达水平，下调其VEGF、TFPI蛋白质水平。创新处：1．转染VEGF基因可以上调骨髓间质干细胞TFPI基因。2．尾静脉注射转染VEGF基因的骨髓间质干细胞可以上调动脉粥样硬化鼠主动脉TFPI表达。3．沉默VEGF基因可以下调骨髓间质干细胞TFPI基因。4．尾静脉注射转染VEGF-siRNA基因的骨髓间质干细胞可以下调动脉粥样硬化鼠主动脉TFPI表达。