研究背景与目的端粒(telomere,TE)是存在于染色体末端保护染色体的帽状结构,在维持基因组的结构完整性和稳定性上起到关键性作用。在正常人体细胞中,端粒是是随着细胞分裂而缩短,当缩短到一定程度时,染色体DNA将变得不再稳定,细胞开始出现衰老或死亡。人端粒酶(telomerase, TM)是由人端粒酶RNA组分(hTR),人端粒酶相关蛋白(hTRP)和人端粒酶逆转录酶(hTERT)三部分组成的蛋白质复合物。它能以自身RNA为模板通过逆转录方式,不断合成新的端粒重复序列并连接端粒,防止端粒缩短从而使得细胞出现永生化。有研究报道指出端粒酶活性在大部分肿瘤组织中被检测到,这表明端粒酶的激活可能是肿瘤发生,发展的关键因素。因此,端粒酶是识别肿瘤细胞存在的重要标志。最近研究发现,端粒酶也可发挥端粒外的作用,可通过调节NF-κB通路和Wnt/β-Catenin通路等作用,促进肿瘤的形成,这些端粒外作用与肿瘤的发生、发展有着密切联系,端粒酶被视为一个抗肿瘤的潜在靶点。人端粒酶逆转录酶(hTERT)是人端粒酶的重要组成部分。由于hTERT mRNA的表达与端粒酶活性密切相关并一致,所以通常认为hTERT是端粒合成的限速酶,对维持肿瘤细胞的生长起到非常重要的作用。细胞hTERT活性被抑制会使端粒酶活性降低,促进细胞中端粒逐渐缩短。hTERT蛋白包括胞浆和核仁之间的穿梭运输蛋白,有研究表明,hTERT直接与NF-κB靶基因启动子DNA结合并与P65亚基作用后可启动有关癌基因表达,同时也阐明了hTERT通过调节NF-κB通路可促肿瘤作用的重要机制。hTERT结构包括N端、逆转录区和C端,尽管C端保守性较低,但研究中证实hTERT C端具有调节端粒酶核转位功能。C端对人端粒酶活性很重要,hTERT通过相关蛋白与端粒DNA结合后,使端粒引物末端正好位于端粒酶RNA(TR)模板区起始端位置,这个步骤是使端粒不断延伸的关键所在。有研究报道,有人设计只含有hTERT C端和部分逆转录区片段,因分子量为27 kDa,故命名为hTERT C27。该片段在Hela细胞内过表达能抑制肿瘤细胞增殖并诱导凋亡,增加5-FU的抗肿瘤活性,其机制目前还不清楚。现有的研究表明,C27不抑制端粒酶活性,其抗肿瘤活性与引起染色体端-端融合,并可能与细胞粘附、细胞周期、免疫反应等有关。本课题前期在hTERT C端截取编码第936-1132氨基酸的碱基序列片段,构建了真核和原核表达载体。该基因序列包括一个核仁定位信号序列(第965-981氨基酸)和与五个端粒DNA结合的氨基酸序列(第963-972、993-1002、1047-1056、1077-1086、1108-1117氨基酸)。由于表达的hTERT C末端包含197个氨基酸,我们把它命名为C197。前期的研究表明,C197能够抑制Hela细胞增殖。但表达量不高,不便于后续研究。为了便于体内试验和增强表达效果,本研究利用过表达载体重组腺病毒PAdEasy-1载体系统,构建了能高效表达C197片段的重组腺病毒Ad-GFP-C197,通过观察C197过表达在体内外对肿瘤细胞增殖的影响,并对其作用机制进行初步探讨,为进一步研究hTERT的C末端功能打下基础,同时也为肿瘤的生物治疗提供新的思路。方法1.重组腺病毒Ad-GFP-C197构建与表达1.1 C197基因片段的获取根据GenBank公布的人hTERT基因序列,选取C端第936-1132氨基序列片段(命名为C197),在该片段中的C端引入Ecor V限制性酶切位点,在N端引入6个his标签和Sal Ⅰ限制性酶切位点,片段总长度为650 bp,将其合成后克隆至pGSI载体保存。使用时经双酶切后经过回收纯化得到外源基因片段C197即可。1.2重组腺病毒Ad-GFP-C197的构建将带有6个his标签C197的cDNA序列克隆至穿梭质粒PAdTrack-CMV得到重组质粒PAdTrack-CMV-C197,经Pme I酶切线性化后转化进入到含有骨架质粒PAdEasy-1的BJ5183细菌中进行同源重组,得到重组大质粒PAd-GFP-C197并进行一系列鉴定,确定构建成功后,将其转染进入HEK293细胞中进行包装,得到重组腺病毒Ad-GFP-C197。对照腺病毒Ad-GFP按照同样的方法进行构建。1.3 目的蛋白C197的表达把重组腺病毒Ad-GFP-C197感染新的一批HEK293细胞,提取细胞RNA和细胞总蛋白后,用荧光定量PCR方法检测C197 mRNA的转录情况,用免疫印迹法检测鉴定目的蛋白C197表达情况。1.4重组腺病毒滴度测定HEK293细胞铺于24孔板中,每孔5×105细胞。重组腺病毒用PBS稀释成10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10- 76个梯度。待细胞贴壁后,将稀释好的病毒每孔加入50 ul,每组实验共3个复孔。48 h观察并计算绿色荧光数。荧光数在20-50个最佳。按照公式：病毒滴度PFU/ml=[(一个视野的荧光数)*每个孔的视野数]/(加入的病毒体积*稀释倍数)计算病毒滴度即可。1.5 C197蛋白的表达与纯化按常规细胞培养方法对Hela细胞细胞进行复苏、传代等操作。将Hela细胞按照1×106铺板于100 mm2培养皿中(共15个皿),待细胞密度为80%时,进行实验干预(用重组腺病毒Ad-GFP-C197用冷的无菌PBS稀释后,以MOI=100感染各培养皿中Hela细胞)；待24 h后换液并在荧光显微镜下观察绿色荧光,于48 h收集细胞并提取总蛋白,利用金属(Ni2+)柱(镍柱)将带有his标签的C197蛋白挂住,用梯度咪唑溶液进行洗脱,回收洗脱液行SDS-PAGE后经考马斯亮蓝染色后观察25 KDa附近是否有条带即可。1.6重组腺病毒Ad-GFP-C197对Hela细胞增殖及细胞凋亡的影响按常规细胞培养方法对Hela田胞进行复苏、传代等操作。将Hela细胞按1×104个接种到96孔培养板中,Hela细胞接7块96孔板,共2个实验组(n=6),待细胞贴壁后进行实验干预。实验干预后每隔24h取出一块96孔培养板,MTT法测量所有实验孔OD值,对照病毒组和重组腺病毒组各有6个单独样本并对其OD值进行统计学分析。将Hela细胞按1×105个接种到24孔培养板中。接3块24孔板,共2个实验组(Ad-GFP-C197组和Ad-GFP组,n=3),待细胞贴壁后进行实验干预。实验干预后分别于24 h、48 h和72 h取出24孔培养板,按照Annexin V-PE凋亡试剂盒说明书处理样品后上流式细胞仪进行检测并收集数据,根据早期凋亡细胞占活细胞数的比例来计算凋亡率并进行统计；以上均数据采用SPSS13.0统计软件,使用单因素方差分析的方法对数据进行统计分析,分析其是否具有显著性差异。2重组腺病毒Ad-GFP-C197的细胞内定位及对Hela细胞中端粒酶活性的影响按常规细胞培养方法对Hela细胞进行复苏、传代等操作。将Hela细胞按1×105个接种到10 mm2共聚焦小皿中,待细胞贴壁后,进行实验干预；分别于24 h和48 h用4%多聚甲醛固定后通过TRITC-二抗免疫荧光染色,细胞核用DAPI染色后,在免疫共聚焦显微镜下观察C197蛋白位移情况。同时将Hela细胞按2×105个接种6孔培养板中,待细胞贴壁后进行实验干预。收集Ad-GFP-C197感染24 h、48 h和72 h后的Hela细胞,对照病毒Ad-GFP感染72 h的Hela细胞以及正常的Hela细胞。分别提取总蛋白并调成一致浓度,按照TRAPEZE(?) Telomerase Detection Kit说明书操作；产物行12.5%聚丙烯酰胺凝胶电泳后用EB溶液染色30min,纯水泡30min后于凝胶成像系统下拍照。3 hTERT蛋白和NF-κB通路相关因子表达的检测按常规细胞培养方法对Hela细胞进行复苏、传代等操作。将Hela细胞按2×105个／孔接种到6孔培养板中,待细胞贴壁后进行实验干预。提取各组细胞蛋白后,用免疫印迹法检测hTERT蛋白、P65蛋白和IκBα蛋白表达情况。4 重组腺病毒Ad-GFP-C197体内对肿瘤的作用按常规细胞培养方法对Hela细胞进行复苏、传代等操作。取周龄为4-6周的雄性裸鼠在12 h日夜交替光照的条件下培养,收集好Hela细胞后与Matrigel调整细胞密度为5×107个/mL,每只裸鼠的右下肢皮下接种0.2 ml Hela细胞。待肿瘤直径达到4-6 mm时,随机分为两组并进行瘤内给药Ad-GFP-C197和Ad-GFP。一周两次,每隔1周测量一次体积,共给药5周。根据每周体积绘制各组肿瘤生长曲线并进行统计学分析。最后一周将各组肿瘤组织取出并拍照,对其称重后进行统计学分析；4%多聚甲醛固定后用Tunel法检测各组肿瘤组织的凋亡情况；并用免疫组化法检测各组肿瘤组织中P65、IκVα蛋白表达情况。另取一部分组织提取总蛋白行免疫印迹测定C197表达情况。结果与结论1.成功构建了重组腺病毒Ad-GFP-C197,且C197能够在细胞中得到高效表达。2.依照单因素方差分析结果显示,重组腺病毒Ad-GFP-C197对Hela细胞具有诱导凋亡作用,并明显抑制细胞增殖,在感染后第六天增殖抑制率和细胞凋亡率最大(分别为49.49%和38.07%)。3.在重组腺病毒Ad-GFP-C197感染后的Hela细胞中观察到C197蛋白能够从细胞质进入到细胞核,也验证了hTERT C端含有核仁定位信号。4.C197蛋白纯化结果显示出三条蛋白条带,且在分子量大小为25 KDa附近出现一条明显的蛋白条带,进一步验证了C197蛋白表达后的确表达了且大小约为25KDa,同时为C197蛋白纯化提供实验基础。5.重组腺病毒Ad-GFP-C197能够抑制Hela细胞中端粒酶活性,并且能够下调hTERT蛋白的表达。6.重组腺病毒Ad-GFP-C197明显抑制Hela细胞中IκBα、P65蛋白的表达水平；提示Ad-GFP-C197的抗肿瘤作用与影响NF-κB通路的活性有关。7.体内实验结果表明,在肿瘤组织中注射重组腺病毒Ad-GFP-C197,肿瘤组织能表达C197,且Ad-GFP-C197能明显抑制肿瘤组织的生长,促进肿瘤细胞凋亡,下调肿瘤组织中IκBα、P65蛋白的表达。