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β-甘露聚糖是非淀粉多糖中的一种,是以β-1,4-D-吡喃甘露糖呈线状连接而成的多聚体,广泛存在于自然界的多种植物细胞壁中。β-甘露聚糖酶是一种多功能的促生长剂,可以促进类胰岛素生长因子IGF-I的分泌,促进蛋白质的合成,因此β-甘露聚糖酶在动物饲料中具有重要用途。短小芽孢杆菌AGI16498.1来源的甘露聚糖酶基因共1104 bp,编码合成的蛋白质由368个氨基酸组成。利用基因工程手段可实现外源肽或蛋白质结构域以融合形式展示在微生物表面即微生物表面展示。近年来,将酶展示在细胞表面这一技术,广泛用于工业的全细胞生物催化。被表面展示的酶具有稳定性强,下游生产花费低的特点。由于甘露聚糖酶具有重要应用价值,本实验通过融合sf-GFP实现了来源于短小芽孢杆菌AGI16498.1的甘露聚糖酶在大肠杆菌的表面展示及其在胞外的分泌表达。主要内容如下:1.甘露聚糖酶引物合成根据大肠杆菌表达载体pET-23a以及甘露聚糖酶和sf-GFP的序列分别设计正反向引物,载体上有6×His tag,便于重组蛋白的Western blot检测以及纯化。利用PCR的方法扩增目的基因。2.表达载体的构建将扩增好的基因片段回收后通过无酶克隆,使其与实验室已酶切好的的sf-GFP—同克隆到pET-23a载体上。3.转化大肠杆菌并筛选重组子转化大肠杆菌感受态细胞,初步通过大肠杆菌菌落PCR初步筛选正确质粒。接种后培养到一定OD值,获得全细胞,进行SDS-PAGE检测和Western blot鉴定筛选大肠杆菌正确重组子,将正确表达的大肠杆菌重组子命名为pET23a-sfGFP-MAN。4.甘露聚糖酶的表面展示对培养后的菌液进行处理,分别获得上清、外膜、周质空间、内膜和全细胞的蛋白质,再次进行SDS-PAGE检测和Western blot鉴定甘露聚糖酶表面展示的定位。由于融合的sf-GFP锚定蛋白带有绿色荧光,可以携带融合的蛋白到达外膜进行全细胞表面展示,所以可以通过荧光共聚焦显微镜观察大肠杆菌表面展示甘露聚糖酶的状况。利用流式细胞仪（FCM）对表达的甘露聚糖酶的大肠杆菌发出的荧光信号进行分析。5.全细胞表面展示甘露聚糖酶的性质经过测定,全细胞表面展示甘露聚糖酶的最适温度为55℃,最适pH为5.5。在pH 4.5-9范围内稳定。45℃、50℃条件下孵育3 h后剩余活性均在70%以上。金属Cu2+、K+、Cd2+对全细胞表面展示的甘露聚糖酶有激活作用。6.甘露聚糖酶酶学性质将分泌表达的甘露聚糖酶纯化,利用NI-NTA亲和层析以及蛋白质纯化仪。经过测定,该甘露糖酶的最适温度为45℃,最适pH为6.5。在pH 5-8范围内稳定。45℃、50℃条件下孵育3 h后剩余活性均在80%以上。金属K+、Ca2+对该甘露聚糖酶有较强激活作用。