论文部分内容阅读
研究背景:缺血性脑卒中（脑缺血）因其较高的发病率、致死率及致残率,已发展成为严重威胁人类健康的全球性疾病。组织型纤溶酶原激活剂（tPA）是目前临床上唯一获准用于脑缺血治疗的药物,然而由于其治疗时间窗较窄、并发症危险,只有不到5%的患者可以得到有效治疗。脑缺血治疗的根本目的在于神经元保护,然而,目前临床上还没有具备确切疗效的脑缺血神经保护药物获准使用。因此,研究开发能提高神经元耐受、延长治疗时间窗甚至逆转神经元损伤的新型脑缺血神经保护药物已迫在眉睫。目的:通过系统的结构分析,探索不同连接方式的葡萄糖醛酸寡糖的制备工艺,并对它们进行临床前脑缺血神经保护药效学评价,筛选出活性糖链并初步判断葡萄糖醛酸寡糖的连接方式对其活性和潜在成药性的影响。方法:该论文主要通过对复杂糖链反应体系系统的结构分析,深入探讨并确定了不同连接方式的线性葡聚糖到相应的葡萄糖醛酸寡糖的制备工艺和机理。再此基础上,在细胞水平、动物水平探讨了不同连接方式的葡萄糖醛酸寡糖对脑缺血模型神经保护作用的影响。首先,以自然界中广泛存在的具备不同连接方式的线性葡聚糖,即可溶性淀粉（α1→4）、微晶纤维素（β1→4）及凝胶多糖（β1→3）,为原料,运用2,2,6,6-四甲基哌啶-1-氧基/溴化钠/次氯酸钠（TEMPO/NaBr/NaClO）系统对其进行特异性氧化改造,制备均一的葡萄糖醛酸寡糖。在此过程中,运用红外光谱（IR）、核磁共振波谱（NMR）、凝胶渗透色谱串联多角度激光散射（GPC-MALLS）结合超高效液相色谱串联四级杆飞行时间质谱（UPLC-Q/TOF-MS）,对产物的精细结构进行解析,探讨三种不同多糖氧化制备相应糖醛酸寡糖的反应机理,确认目标糖链的制备工艺和精细结构。在针对性地获得分子量一致,但连接方式不同三种葡萄糖醛酸寡糖后,首先对它们进行体外脑缺血神经保护活性研究,期间主要针对糖氧缺乏（OGD）条件下的小鼠海马神经元细胞（HT-22）损伤模型,评价了药物对细胞存活率的影响。其次,通过对不同类型葡萄糖醛酸寡糖在新西兰兔血浆与脑脊液中的药物浓度的测定,初步探讨这些不同连接的葡萄糖醛酸寡糖在透过血脑屏障能力方面可能对其体内药效学的影响。最后,考察了不同连接方式对糖醛酸寡糖在运用线栓造小鼠短暂大脑中动脉阻塞模型（tMCAO）中对缺血脑组织的保护作用的影响。结果:1)在TEMPO系统介导的可溶性淀粉的氧化过程中,温度和氧化剂的加入量是控制氧化率的两个关键因素。控制反应温度25°C及1.2倍当量的次氯酸钠溶液（含5%活性氯）,可以一步制备每个糖环中只含一个阴离子且还原端开环的α1→4葡萄糖醛酸寡糖同系物,产物的重均分子量（Mw）、数均分子量（Mn）及多分散系数（Polydispersity）分别为,3.6 kD、2.1 kD及1.7,高温和低温都不利于特异性氧化的完成。在TEMPO系统介导的丝光化纤维素的氧化过程中,温度和氧化剂的加入量同样是控制氧化率的两个关键因素。控制反应温度50°C及0.5倍当量以上的次氯酸钠溶液（含5%活性氯）,可以一步制备每个糖环中只含一个阴离子且还原端开环的β1→4葡萄糖醛酸寡糖同系物,产物中同样有聚糖存在,室温下反应难以进行。在TEMPO系统介导的凝胶多糖的氧化过程中,特异性氧化效率较高,当氧化剂的量为0.8倍当量时,不同反应温度下（4、25、50°C）都可以得到每个糖环上只含一个阴离子的β1→3葡萄糖醛酸聚糖且产物的Mw随着温度的升高逐渐降低分别为,49.8kD、29.8 kD及7 kD,这些β1→3葡萄糖醛酸聚糖可以通过进一步的三氟乙酸降解得到每个糖环上只含一个阴离子且还原端闭环的β1→3葡萄糖醛酸寡糖同系物。经过针对性的工艺制备得到了三种、糖基组成、分子量和分子量分布相同但连接方式不同葡萄糖醛酸寡糖。2)在细胞水平上,三种不同连接的葡萄糖醛酸寡糖在3个实验剂量（0.1、1、10μg/ml）下对于正常培养的HT-22细胞的存活率均无影响。在这3个剂量下,α1→4和β1→3葡萄糖醛酸寡糖均表现出了改善OGD 2h下HT-22细胞存活率的趋势,且在较高浓度下（10μg/ml）与模型组相比有显著性差异（p<0.05）。β1→4葡萄糖醛酸寡糖抑制OGD 2h对HT-22细胞损伤的活性最突出,其0.1μg/ml组与模型组相比就有显著性差异（p<0.05）且10μg/ml细胞存活率已经接近正常组水平。α1→4葡萄糖醛醛酸寡糖并没有在新西兰兔脑脊液中的检测到,而β1→4和β1→3葡萄糖醛酸寡糖在新西兰兔脑脊液中检测到,Tmax分别为0.5和2小时。这个结果表明β型葡萄糖醛酸寡糖能够特异性的通过血脑屏障进入脑脊液,而α型寡糖不能进入。3)动物实验结果表明,β1→4葡萄糖醛酸寡糖能显著降低tMCAO 2h引起的小鼠单侧脑梗死体积,而相同剂量下的α1→4葡萄糖醛酸寡糖无明显活性,β1→3葡萄糖醛酸寡糖有趋势但并不显著。结论:以不同的直链葡聚糖为原料可以在TEMPO/NaBr/NaClO体系下分别以不同的反应条件获得不同连接方式的葡萄糖醛酸寡糖。在此过程中,首次深入探讨了不同连接方式葡聚糖特异性氧化的反应机理,并确定了针对不同连接方式葡萄糖醛酸寡糖的制备工艺。体内、体外实验结果表明,β1→4葡萄糖醛酸寡糖能够顺利通过血脑屏障进入脑脊液对受损神经细胞加以保护,显著优于同剂量下的α1→4和β1→3葡萄糖醛酸寡糖。这项工作创造性的获得了β1→4葡萄糖醛酸寡糖这类脑缺血神经保护化合物,阐明了该连接方式对于阴离子寡糖脑缺血神经保护活性的重要意义,初步研究也为其药物开发提供了可行性支持。