论文部分内容阅读
弧菌广泛存在于海水、沉积物及海洋动物体中,是海水鱼、虾、贝类的一种常见致病菌,也是引起人类急性肠胃炎的主要病原微生物,对人类身体健康造成很大威胁。而目前检测海洋弧菌的方法存在耗时长,过程繁琐等缺点,无法满足海产品的监测需要。因此需要研制出一种耗时短、操作简单的快速检测方法。胶体金免疫层析技术(GICA)是九十年代以来新发展起的一种快速检测技术,并已应用在许多方面的检测。其耗时短、操作简单、特异性强等特点,使其在现代食品检测工作中发挥重要作用。本实验用甲醛灭活法制备副溶血性弧菌(Vp)和霍氏格里蒙菌(Gh)全菌抗原并免疫新西兰大白兔,得到多克隆抗体血清,并使用辛酸-硫酸铵盐析法进行纯化,得到Vp全菌抗体、Gh全菌抗体1和抗体2,经ELISA法测定其效价分别为:1:32000、1:64000、1:16000,Bradford法测定抗体浓度分别为21.06、19.20、19.11 mg/mL,经SDS-PAGE鉴定抗体纯度较好,可为后续试验所用。本实验采用柠檬酸三钠法制备20 nm粒径的胶体金,并用于标记抗体,确定Vp多抗和Gh多抗1的最佳蛋白标记量分别为27.6μg、21.6μg;选择金标探针稀释液配方为:0.01mol/L Tris-HCL(1%BSA、0.5%PEG 20000、5%蔗糖、0.5%Tween-20),样品垫处理液配方为:0.01 mol/L的PB溶液(1%BSA、1%蔗糖、0.5%Triton-100、1%tween-20);组装成试纸条后,Vp试纸条的灵敏度为10~3 cfu/ml,Gh试纸条的灵敏度为10~5 cfu/ml;经测试,两种试纸条均具有较好的特异性与稳定性,室温下可保存90 d;当样品中含有杂菌时,检测灵敏度不受影响。本实验建立了免疫磁珠分离富集目的菌的方法,确定最佳免疫磁珠用量为60μL,最佳捕获时间为30 min。并将离心富集与免疫磁珠富集方法对试纸条灵敏度的提升情况作了对比;GICA直接检测明虾、海蛎、花蛤、鱿鱼样品中的Vp时,灵敏度可达10~5 cfu/ml;检测人工污染明虾、海蛎样品(4 cfu/g)时,经8 h增菌即可检出;直接检测海蛎样品中Gh时,灵敏度为10~6 cfu/mL;IMS-GICA联合检测海蛎样品中Vp时,灵敏度为10~4 cfu/mL,联合检测样品中Gh时,灵敏度为10~5 cfu/mL;