现代食品安全包含了食品的卫生安全和消费健康安全。近年来,由于膳食结构不合理,导致营养平衡失调产生的非传染性慢性疾病,已经成为人们关注的社会问题。食物中油脂含量高,特别是其脂肪酸组成不合理,是重要诱因。重庆麻辣火锅,为重庆特色餐饮方式,已风靡全球。重庆麻辣火锅底料(简称火锅底料,下同)由过量的动物性脂肪(牛油为主)、辣椒、花椒、姜、蒜等经高温炒制、熬制而成。作为一种重庆特色调味食品,火锅底料现已实现工业化生产并远销国内外,不仅仅应用于火锅,家庭烹饪炒菜、调味也广为使用。渝菜味型也是脱胎于麻辣火锅风味。火锅底料历年来曾出现过卫生安全性问题,如―毒毛肚、工业色素、工业石蜡、火锅老油‖等;火锅食用时,火锅底料经长时间、反复高温加热,其中的危害因子(极性组分、反式脂肪酸)会发生何种变化;在火锅煮制过程中,会不断加入蔬菜、肉品、海鲜等,是否会引起亚硝酸盐、硝酸盐、胆固醇的超标;以上问题至今并未得到系统研究,随着火锅底料走向世界,对其质量安全标准的要求会更为严格。火锅底料含有大量动物性脂肪、辣椒、花椒等麻辣刺激性物质,食用火锅易引起消费者胃肠道不适,出现滑肠、腹痛等症状,可能导致直肠炎、结肠炎等消化道疾病。如何确保食客在享受美味的同时,没有精神负担和身体负担,保证食用火锅对身体健康安全,课题组创新性将安全的食材配方,创制的魔芋桑叶复配粉(简称复配粉,下同),对消除食用火锅引起的肠胃不适有很好的改善作用,但其作用机理尚不清楚。为保证重庆火锅行业健康、可持续发展,本文全面、系统研究了火锅底料的卫生安全性和消费健康安全性及干预作用效果机理。首先,通过火锅底料中危害因子的检测、暴露风险评估及火锅底料反复加热和长时间煮制菜肴过程中危害因子的变化评价火锅底料的卫生安全性。从重庆企业和火锅餐饮店采集100组不同的火锅底料,采用液相色谱法、气相色谱法、离子色谱法、原子吸收分光光度法、原子荧光光度法、分光光度法等方法对火锅底料中的危害因子:7种金属元素(重金属元素-铅、砷、汞、镉、铬及过量时对人体带来危害的金属元素锌、锰、铁、铜)、酸价、过氧化值、亚硝酸盐、丙二醛、苯并(a)芘、极性组分、反式脂肪酸、7种非食用色素(碱性橙Ⅱ、罗丹明B、对位红、苏丹红Ⅰ、苏丹红Ⅱ、苏丹红Ⅲ、苏丹红Ⅳ))进行检测,采用蒙特·卡罗(Monet Carlo)模拟技术对以上危害因子进行暴露风险评估。模拟食用火锅前后的煮制时间、反复煮制次数对火锅汤料中亚硝酸盐、硝酸盐、极性组分、反式脂肪酸、胆固醇等危害因子的含量变化进行了检测。其次,基于以上卫生安全性,以灌胃火锅底料的小鼠为试验动物模型,灌胃不同剂量复配粉,评价火锅底料对胃肠道健康安全性及复配粉的干预机理。采用ELISA酶联免疫试剂盒测定不同分组小鼠血脂和肝脂水平,以及小鼠血清细胞因子水平,主要包括总胆固醇(T-CHO)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、碱性磷酸酶(AKP)、干扰素-γ(INF-γ)、白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素6(IL-6)、白细胞介素10(IL-10)、白细胞介素4(IL-4)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)。采用HE染色法制备肝脏及盲肠组织切片,通过显微镜观察并描述不同分组小鼠组织切片的病理状态。无菌条件采集不同分组小鼠盲肠内容物,采用16S r RNA高通量测序技术评价盲肠微生物种类及结构多样性。最后,采用RT-q PCR和Western Blot技术,基于PPAR和AMPK/SREBPs信号通路,验证复配粉通过调节肠道微生物改善因火锅底料引起的胃肠不适的分子机理。主要包括分析脂蛋白脂酶(LPL)、肉毒碱棕榈酰基转移酶(CPT1)、胆固醇-7α羟化酶(CYP7A1)、过氧化物酶体增值物激活受体α(PPAR-α)、腺苷酸活化蛋白激酶α(AMPKα)、肝X受体α(LXR-α)、CCATT增强子结合蛋白α(C/EBPα)、过氧化物酶体增值物激活受体γ(PPAR-γ)等m RNA及蛋白的基因表达。通过本文的研究为火锅底料标准的修改及完善提供理论依据,为指导消费者对重庆麻辣火锅有更好的健康消费体验提供保障,同时有利于监管部门有效监管火锅底料的卫生安全性。主要研究结果如下:1)重庆火锅底料、复配粉主要成分测定。结果表明,火锅底料中水分、灰分、蛋白质、钠、碳水化合物、胆固醇含量分别为6.5 g/100g、10.8 g/100g、9.4 g/100g、3.39×103 mg/100g、9.0 g/100g、62.6 mg/100g。脂肪含量为64.3 g/100g,每日营养素参考值(60 g)的1.07倍。总能量为2691 k J/100g,其中2379 k J/100g由脂肪提供,占总能量88%,超过每日膳食中脂肪提供能量比例不宜超过总能量30%的规定。49种脂肪酸组成测定结果表明,火锅底料中饱和脂肪酸(SFA)、不饱和脂肪酸(UFA)、反式脂肪酸(TFA)占总脂肪酸的比例分别为61.847%、35.017%、3.909%;单不饱和脂肪酸(MUFA)、多不饱和脂肪酸(PUFA)分别占总UFA的比例为31.791%、3.227%。火锅底料中钠含量为3.4×103 mg/100g,每日营养素参考值(2.0×103 mg)的1.7倍。火锅底料中花椒麻味物质含量为457.3 mg/kg,辣椒素含量为129.0 mg/kg。复配粉中水分、灰分、蛋白质、脂肪、钠、碳水化合物、能量分别为5.8 g/100g、0.2 g/100g、0.8 g/100g、0 g/100g、0 mg/100g、57.6 g/100g、134.1 k J/100g。膳食纤维含量为35.5 g/100g,超过每日营养素参考值(25 g)的1.42倍。2)火锅底料中危害因子检测及暴露风险评估。首先,建立了一种可以同时测定火锅底料中7种非食用色素的高效、快速、准确的氧化铝柱-高压液相色谱法。火锅底料中7种非食用色素一次性采用乙醇和正己烷:丙酮(v/v 9:1)混合溶液分步提取,经氧化铝柱净化后,通过二极管阵列检测器(DAD)-高压液相色谱仪,分时间段变波长(0~7 min 440 nm;7~9 min 548nm;9~13 min 480 nm;13~20 min 520 nm)条件下,以0.02 mol/L乙酸铵(p H=4.0)和乙腈为流动相,梯度洗脱,外标法定量。然后,100组火锅底料中危害因子测定结果表明,铅、极性组分、苯并(a)芘不合格率为1%,酸价不合格率为18%,砷、过氧化值、丙二醛、反式脂肪酸、7种非食用色素均符合食品安全国家标准的限量规定。最后,基于100组火锅底料中危害因子的测定数据,建立危害因子暴露风险评估模型。评估结果表明,摄食重庆火锅底料对重庆居民砷、汞、铜、锌、锰、亚硝酸盐、反式脂肪酸、7种非食用色素危害风险的概率为0%;铅、镉、铬、铁、过氧化值、丙二醛对重庆居民带来危害风险的概率小于10%。酸价、极性组分、苯并(a)芘对重庆居民带来危害风险的概率大于10%。3)研究火锅底料反复加热和长时间煮制菜肴过程对危害因子的影响。火锅汤料是由油、水和粉末、固态物质构成的复杂油水混合体系,汤料含有的成分会随着烫煮的菜品一起进入消费者体内。结果表明,模拟食用火锅前后火锅汤料中硝酸盐、极性组分、胆固醇含量显著增加(p<0.05),亚硝酸盐含量无显著变化(p>0.05),反式脂肪酸含量显著降低(p<0.05)。随着煮制时间的延长,火锅汤料中亚硝酸盐、极性组分含量显著增加(p<0.05),硝酸盐含量先增加后减少,胆固醇、反式脂肪酸含量无显著变化(p>0.05);火锅底料反复煮制5次(1次=5 h),火锅汤料中极性组分含量显著增加(p<0.05),反式脂肪酸含量无显著变化(p>0.05)。4)复配粉对饲喂火锅底料小鼠生化指标、细胞因子、组织病理切片的影响。以60只昆明小鼠为研究对象,将小鼠分为空白对照组(Blank control group,BC)、火锅底料模型组(Model control group,MC)、复配粉高(High dose group,HD)、中(Medium dose group,MD)、低(Low dose group,LD)剂量组。除BC组,其余分组小鼠分别灌胃0.1 m L/10g重庆火锅底料(Chongqing hotpot seasoning,CHS),30 min后,所有受试物组灌胃复配粉(灌胃剂量为364、182、91 mg/kg),连续灌胃4 w。试验结果表明,与BC组相比,MC组小鼠血清及肝脏组织中T-CHO、TG、AST、ALT、AKP、INF-γ、IL-1β、IL-6水平显著升高(p<0.05),IL-10、IL-4水平变化不显著(p>0.05),HDL-C与LDL-C的比值显著降低(p<0.05)。MC组肝板排列尚规整,肝细胞气球样变性,少量淋巴细胞浸润、伴肝细胞点灶坏死,盲肠组织肠腺排列稀疏不规整,上皮细胞脱落、完整性破坏、黏膜层变薄,杯状细胞数量明显减少,有炎性细胞浸润。说明火锅底料的摄入导致小鼠机体脂代谢紊乱、肝损伤和肠道炎症反应的发生。与MC组相比,HD组血清及肝脏组织中T-CHO、TG、LDL-C、AST、ALT、AKP、INF-γ、IL-1β、IL-6含量显著降低(p<0.05),HDL-C含量显著升高(p<0.05),TNF-α、IL-10水平有下降趋势,IL-4水平有上升趋势,但差异不显著。肝脏、盲肠组织形态接近于BC组。说明复配粉的干预可改善小鼠机体脂代谢紊乱、预防肝损伤及肠道炎症反应。5)复配粉对饲喂火锅底料小鼠盲肠内容物中微生物及短链脂肪酸的影响。肠道微生物16S r RNA高通量测序结果表明,各分组小鼠盲肠内容物中总共注释到10门,21纲,32目,62科和160属的细菌。试验中测定的OTU分属于以下10门:厚壁菌门(firmicutes)、拟杆菌门(bacteroides)、变形菌门(proteobacteria)、放线菌门(actinobacteria)、脱铁杆菌门(deferribacteres)、疣微菌门(verrucomicrobia)、螺旋菌门(spirochaetae)、saccharibacteria、蓝细菌(cyanobacteria)及软壁菌门(tenericutes)。其中厚壁菌门和拟杆菌门在所有样本中均属于优势菌群,其相对丰度之和均大于80%。与BC组相比,MC组小鼠肠道菌群OTU数低,厚壁菌门与拟杆菌门的比值(F/B)高,乳杆菌目含量降低,肠杆菌目含量升高,与碳水化合物转运和代谢相关的微生物相对较少、脂肪转运和代谢相关微生物相对较多,乙酸、丙酸、异丁酸、丁酸、异戊酸、戊酸、总SCFA含量显著降低。说明火锅底料的摄入降低小鼠肠道微生物种类及结构多样性、减少肠道代谢产物SCFA含量。与MC组相比,HD组OUT数显著增加,盲肠微生物多样性显著升高,乙酸、丙酸、异丁酸、异戊酸、戊酸、总SCFA含量显著增加(p<0.05),丁酸含量差异不显著,但仍有增加的趋势。表明复配粉通过干预肠道微生态改善火锅底料小鼠机体脂代谢紊乱及肠道炎症的机理。6)复配粉对饲喂火锅底料小鼠肝脏脂代谢相关基因及蛋白表达的影响。结果表明,与BC组相比,MC组LPL、CPT1、CYP7A1、PPAR-α、AMPK-α表达水平显著降低(p<0.05),LXR-α、C/EBP-α表达水平显著升高(P<0.05)。表明火锅底料的饲喂,导致小鼠肝脏中与脂肪分解代谢相关基因及蛋白表达水平降低,与脂肪合成代谢相关基因及蛋白表达水平升高。与MC组相比,HD组LPL、CPT1、CYP7A1、PPAR-α、AMPK-α表达水平显著升高(p<0.05),LXR-α、C/EBP-α表达水平显著降低(p<0.05),PPAR-γ表达水平不显著(p>0.05),但有下降趋势。说明复配粉可促进调节生物体内胆固醇代谢,脂肪酸β氧化和脂肪的分解,进一步通过分子机理,验证复配粉通过干预肠道微生态改善火锅底料小鼠机体脂代谢紊乱及肠道炎症。