目的： 在老年人中，阿尔茨海默氏病(AD)是痴呆发生最为常见的原因，在美国人的死因中占第四位。它的临床特征包括进行性的痴呆，渐进的认知能力下降。它主要的神经病理特征包括老年斑、神经纤维缠结及神经元和突起的丢失。老年斑和脑血管内沉积的主要成份是β—淀粉样蛋白(Aβ)，它由39—43个氨基酸残基组成，是淀粉样蛋白的前体蛋白经过剪切形成。Aβ的聚集被认为极可能是AD早期的必要因素。 脑血管功能失调促进AD认知能力下降和痴呆的发生。血脑屏障主要由脑微血管内皮细胞、内基膜和神经胶质膜构成，是脑和循环系统之间的一个代谢和生理性屏障结构，血脑屏障的功能在于阻止循环中的药物、毒素等外源物质入脑以保护中枢神经系统免受损害。体外分离培养的人脑微血管内皮细胞(HBMECs)就成为研究血脑屏障功能的理想对象。 近年的越来越多的证据表明，炎症机制在AD发病机制中起着至关重要的作用。趋化因子属于细胞因子家族，主要功能是募集单核细胞到炎症部位。趋化因子受体5(CCR5)是一种趋化因子的受体，免疫组织化学研究表明，AD病人Aβ的沉积伴随活化的胶质细胞中CCR5表达增加，这提示CCR5在调节AD病人的免疫反应中发挥作用。在我研究室以前的研究中，发现Aβ能够上调HBMECS表面的CCR5蛋白表达，但其机制和意义并不清楚，本研究试图回答该问题。 血脑屏障(BBB)通过内皮细胞上的晚期糖基化末端产物受体(RAGE)和低密度脂蛋白受体相关蛋白—1(LRP—1)运输Aβ。RAGE是细胞表面分子免疫球蛋白超家族的一员，能够与Aβ相互作用，是与AD发病相关的一个重要蛋白。在构成血脑屏障的内皮细胞上，Aβ与RAGE相互作用引起循环中的Aβ通过跨细胞作用进入脑内。在AD病人的脑内，RAGE的表达增加，使得进入脑内的Aβ增加并且在脑内聚集，这与AD的发病机制相关。近年证实RAGE存在几种亚型，它们编码缺少了跨膜和胞浆段的截短的RAGE，这些分泌型的RAGE能够与RAGE的配体结合，抑制RAGE的配体和受体相互作用，进而抑制配体/受体轴的信号传递，这为我们寻找预防和治疗AD的有效方法提供一些新的思路。 那么Aβ是通过什么信号通路上调HBMECs上的CCR5表达？CCR5表达上调有什么重要的生物学意义呢？运输循环系统中Aβ进入中枢神经系统(CNS)的RAGE是否参与了CCR5表达上调的过程呢？这些问题与AD病人的发病机制密切相关，解决上述问题可望为我们寻找预防和治疗AD病人的医疗方案积累一定的理论基础。因此，本文主要针对解决上述问题展开相关的实验。 方法： 一、研究Aβ上调HBMECs上CCR5表达的细胞内分子机制 (一)细胞培养 HBMECS培养于含10％胎牛血清和10％新生牛血清的RPMI1640培养液。 (二)荧光实时定量PCR法 检测不同浓度和不同时间的Aβ对HBMECs上CCR5 mRNA表达的影响。 (三)Western—blot方法 检测不同浓度和不同时间的Aβ对HBMECs上CCR5蛋白表达的影响。 (四)Western—blot方法 检测Aβ对MAPK/PI3K信号通路的影响。 (五)Western—blot方法 检测Aβ对HBMECs上Egr—1表达的影响。 (六)染色质免疫沉淀法 检测转录因子Egr—1与CCR5启动子的结合情况。 (七)建立Egr—1干扰的HBMECs细胞株 Egr—1 siRNAs稳定转染HBMECs的细胞株，并用western—blot方法鉴定及检测CCR5的表达情况。 二、探讨RAGE受体在Aβ上调HBMECs表面CCR5表达过程中的作用 (一)应用RT-PCR方法分析不同浓度和不同时间Aβ对HBMECs上RAGE mRNA表达的影响。 (二)应用Western—blot方法分析不同浓度和不同时间Aβ对HBMECs上RAGE蛋白表达的影响。 (三)应用Western—blot方法检测RAGE中和抗体对Aβ通过MAPK/PI3K信号分子上调CCR5表达的影响。 (四)真核表达载体构建，脂质体稳定转染HBMECs，建立过表达RAGE的HBMECs细胞株(即HBMECRAGE+)。 1、重组质粒pUCmT—RAGE的构建。 2、真核表达载体构建。 3、稳定转染HBMECs细胞株。 (五)真核表达载体构建及稳定转染细胞方法建立RAGE胞内段缺失的HBMECs细胞株(即HBMECC-Truncated RAGE)和RAGE胞外段缺失的HBMECs细胞株(即HBMECN-Truncated RAGE)。 方法同上 (六)应用Western—blot方法检测Aβ对HBMECRAGE+、HBMECC-Truncated RAGE和HBMECN-Truncated RAGE上CCR5的蛋白表达的影响，同时检测后两种转染了截短型RAGE细胞中MAPK和AKT信号分子的表达情况。 三、研究Aβ上调CCR5表达对T淋巴细胞入脑的影响 (一)使用试剂盒分离AD病人外周血T淋巴细胞。 (二)跨内皮迁移实验分析AD病人外周血T淋巴细胞、6T—CEM细胞和Jurkat细胞穿过正常HBMEC单层及各种转染的HBMEC单层的情况。 1、Aβ上调CCR5表达与T淋巴细胞穿过HBMEC单层相关。 (1)不同浓度的Aβ对6T—CEM细胞、AD病人外周血T淋巴细胞和Jurkat细胞穿过HBMECS单层的影响。 (2)6T—CEM细胞、AD病人外周血T淋巴细胞和Jurkat细胞穿过CCR5缺失突变的HBMECs(即HBMECCCR5—)和CCR5过表达的HBMECs(即HBMECCCR5+)单层的情况。 (3) Aβ对6T—CEM细胞和AD病人外周血T淋巴细胞穿过CCR5缺失突变的HBMECs(即HBMECCCR5—)的影响。 2、RAGE受体参与T淋巴细胞穿过HBMEC单层的过程。 (1)RAGE中和抗体对6T—CEM细胞和AD病人外周血T淋巴细胞穿过HBMEC单层的影响。 (2) Aβ对6T—CEM细胞和AD病人外周血T淋巴细胞和JURKT细胞穿过过表达RAGE的HBMECs(即HBMECRAGE+)单层的影响。 (3) Aβ对6T—CEM细胞和AD病人外周血T淋巴细胞穿过RAGE胞内段缺失的HBMECs(即HBMECC-Truncated RAGE)单层和RAGE胞外段缺失的HBMECs(即HBMECN-Truncated RAGE)单层的影响 3、MPAK信号分子参与T淋巴细胞穿过HBMEC单层的过程。 (1)通过脂质体转染法将JNKsiRNAs和ERKsiRNAs分别瞬时转染HBMECs，用Western—blot法鉴定转染细胞中JNK和ERK的表达情况，以及加入Aβ后CCR5的表达情况。 (2)通过脂质体转染法将JNKsiRNAs和ERKsiRNAs瞬时转染到Transwell上室接种的HBMEC单层内。 (3)检测6T—CEM细胞和AD病人外周血T淋巴细胞穿过JNK和ERK干扰后的HBMEC单层的情况。 4、PI3K/AKT信号分子参与T淋巴细胞穿过HBMEC单层的过程。 (1) Western—blot方法：检测PBK缺失突变的HBMECs(即PI3K/△P110)上CCR5的表达情况。 (2) Aβ对6T—CEM细胞和AD病人外周血T淋巴细胞穿过PI3K/△P110的HBMEC单层的影响。 5、Egr—1参与T淋巴细胞穿过HBMEC单层的过程。 Aβ对6T—CEM细胞和AD病人外周血T淋巴细胞穿过Egr—1干扰后的HBMEC单层的影响。 结论： Aβ通过与HBMECs表面的RAGE受体相互作用，活化MAPK和PI3K/AKT信号分子，增强Egr—1与CCR5启动子的结合，上调HBMECs上的CCR5表达，促进T淋巴细胞穿过HBMEC单层。