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内皮素-1(ET-1)是由二十一个氨基酸组成的多肽链，是人体内含量最多的三种内皮素之一。作为神经调质，其广泛表达于中枢神经系统，参与多种疼痛调节。其调节疼痛主要是通过活化内皮素A受体(ETAR)和内皮素B受体(ETBR)实现的，两者皆为其特异性G蛋白偶联受体。ET-1在疼痛调节中发挥重要作用，鞘内注射ET-1可减轻疼痛模型动物的疼痛。相同地，在炎性痛和神经病理性痛模型中，星形胶质细胞过表达ET-1小鼠表现出疼痛减轻，而神经元特异性ET-1敲除小鼠则显示出了相反的结果。在神经病理性痛中，ET-1、ETAR和ETBR表达上调，共同参与疼痛的调节。BCP具有神经病理性痛特征，而ET-1、ETAR和ETBR在BCP中的表达变化，尚不清楚。 蛋白激酶B(Akt)是介导多种细胞增殖、存活和分化的信号传导通路，广泛表达于脊髓背角Ⅰ-Ⅳ层，调节伤害性刺激。其参与炎性痛和神经病理性痛引发的中枢敏化。除Akt外，细胞外调节激酶(ERK)信号通路在突触和神经元可塑性的调节中也发挥重要作用，它同样调节伤害性刺激诱发的外周和中枢敏化。脊髓Akt和ERK通路存在交叉和联系，共同参与神经病理性痛时机体的病理生理学和神经化学变化。在神经病理性痛中脊髓Akt和ERK表达上调，共同促进疼痛的发展。BCP具有神经病理性痛特征，而脊髓Akt和ERK通路在BCP中的作用，尚不清楚。 尽管ET-1调节疼痛通过活化ETAR和ETBR实现，但主要是通过ETAR介导的。如当ET-1施加于暴露的坐骨神经外时，大鼠产生患侧后爪退缩，这种作用可被提前腹腔注射吗啡阻断或完全预防，注射ETA拮抗剂可逆转，但ETBR拮抗剂无效。在热痛模型中，中枢给予ET-1的镇痛作用可被ETAR拮抗剂阻断，而ETBR拮抗剂无效，表明ET-1在中枢神经系统的镇痛作用通过ETAR，而非ETBR介导。在脊髓损伤模型中，鞘内注射ETAR拮抗剂BQ-123可减轻神经病理性痛，而ETBR拮抗剂BQ-788无效，此结果表明，ET-1调节疼痛通过ETAR，并不通过ETBR。脊髓Akt和ERK表达上调参与神经病理性痛的而形成和维持，而抑制Akt和ERK或其上游蛋白的表达可减轻疼痛。鞘内注射ETAR受体拮抗剂BQ-123可下调神经病理性痛小鼠脊髓Akt和ERK表达而减轻疼痛。由于BCP具有神经病理性痛特征，鞘内注射ETAR拮抗剂对小鼠BCP的影响及机制，尚不清楚。 本研究一方面旨在明确脊髓ET-1及其受体在BCP中变化，同时评价脊髓Akt和ERK通路在BCP成形和维持中的作用，为明确BCP机制，发现可能的治疗靶点提供依据;另一方面，通过评价鞘内注射ETAR拮抗剂对小鼠BCP的影响，明确了其减轻BCP的可能分子机制，可为临床BCP治疗方法的研究提供新方向。 本研究分为两部分，第一部分:脊髓ET-1及其受体、Akt和ERK通路在BCP中的变化;第二部分:鞘内注射ETAR拮抗剂通过抑制脊髓Akt和ERK通路减轻对小鼠BCP。 目的： 第一部分:小鼠BCP模型制备成功后，通过检测痛行为学、组织学、脊髓ET-1、ETAR和ETBR基因表达及蛋白表达，Akt和ERK通路蛋白表达，明确ET-1及其受体在BCP中的变化及脊髓Akt和ERK通路在BCP形成和维持中的作用。 第二部分:鞘内注射ETAR拮抗剂BQ-123后，通过检测小鼠痛行为学及脊髓Akt和ERK通路蛋白表达，明确鞘内注射BQ-123对小鼠BCP的影响及可能机制。 方法： 第一部分:NCTC2472肿瘤细胞系培养于含10％马血清NCTC135培养基，培养箱参数设置为37℃，5％CO2和95％O2，细胞每周传代两次。雄性C3H/HeJ小鼠，4～6周龄，体质量20～25g，采用股骨骨髓腔接种NCTC2472肿瘤细胞的方法制备BCP模型。将小鼠随机分为两组:假手术组（Sham组）和骨癌痛组(BCP组)。每组随机选择8只小鼠固定行痛行为学检测，包括自发抬足次数(NSF)和机械缩足反应阈(PWT)。采用盲法，痛行为学检测人员对小鼠的处理方式不知情。于肿瘤细胞接种后-1、7、14和21d分别检测NSF和PWT，随后每组随机处死5只小鼠，取脊髓L4-6节段，采用实时定量PCR法检测ET-1mRNA、ETAR mRNA和ETBR mRNA表达水平。采用Westem blot法检测ET-1、ETAR和ETBR蛋白表达，同时检测磷酸化Akt（p-Akt）、总Akt（t-Akt）、磷酸化ERK-1/2(p-ERK-1/2)和总ERK-1/2(t-ERK-1/2)表达，并计算p-Akt/t-Akt和p-ERK-1/2/t-ERK-1/2。于肿瘤细胞接种后21d，各组分别取患侧股骨行组织学检测。 第二部分:将小鼠随机分为7组:Sham+NS组、Sham+BQ-123组、Sham+BQ-788组、BCP组、BCP+NS、BCP+BQ-123和BCP+BQ-788组。每组随机选择8只小鼠固定行NSF检测，另选择8只小鼠固定行PWT检测。选择L5-6椎间孔穿刺行鞘内注射给药。于肿瘤细胞接种后14d（痛行为学检测后）行鞘内注射，Sham+BQ-123组和BCP+BQ-123组小鼠分别鞘内注射BQ-123(30nmol in7μl per dose)，Sham+BQ-788组和BCP+BQ-788组小鼠分别鞘内注射BQ-788(10nmol in7μl per dose)，Sham+NS组和BCP+NS组注入等量生理盐水，注射速度为1μl/s。痛行为学检测于鞘内注射前即刻及注射后每30min检测一次，至注射后180min。采用盲法，痛行为学检测人员对小鼠的处理方式不知情。痛行为学检测中，于BCP+BQ-123组痛行为学改善最明显的时点，每组随机选择5只小鼠，处死后取脊髓L4-6节段，采用Westem blot法检测p-Akt、t-Akt、p-ERK-1/2及t-ERK-1/2的表达水平，并计算p-Akt/t-Akt和p-ERK-1/2/t-ERK-1/2。 结果： 第一部分:与-1d时比较，Sham组于肿瘤细胞接种后4、7、10、14和21d时NSF和PWT变化差异无统计学意义(P＞0.05)，BCP组于肿瘤细胞接种后7、10、14和21d时NSF升高，PWT降低(P＜0.01或0.001);与Sham组比较，BCP组小鼠7、10、14和21d时NSF升高，PWT降低(P＜0.01或0.001)。组织学结果表明，BCP组小鼠出现肿瘤生长和骨质破坏，肿瘤细胞严重浸润和侵蚀骨皮质，而Sham组小鼠骨质结构基本正常。 与-1d时比较，Sham组小鼠7d、14d和21d时ET-1mRNA、ETAR mRNA和ETBR mRNA及蛋白表达差异无统计学意义（P＞0.05），BCP组小鼠14d和21d时ET-1mRNA、ETAR mRNA和ETBR mRNA及蛋白表达上调(P＜0.05、0.01或0.001)，7d时差异无统计学意义(P＞0.05)。与Sham组比较，BCP组小鼠7、14、21d时ET-1mRNA、ETAR mRNA和ETBR mRNA及蛋白表达上调(P＜0.05，0.01或0.001)。 在观察时点内，Sham组小鼠p-Akt、p-ERK-1/2表达及p-Akt/t-Akt和p-ERK-1/2/t-ERK-1/2并未见明显变化，而BCP组小鼠上述指标呈现时间依赖式的表达上调。与Sham组比较，BCP组小鼠7d、14d和21d时p-Akt和p-ERK-1/2表达上调，p-Akt/t-Akt和p-ERK-1/2/t-ERK-1/2增加(P＜0.05、0.01或0.001）。 第二部分:与Sham+NS组、Sham+BQ-123组、Sham+BQ-788组比较，BCP组、BCP+NS和BCP+BQ-788组小鼠表现为NSF升高和PWT降低(P＜0.001)，且痛行为学指标在鞘内注射后180m in的观察时间内基本保持不变。而鞘内注射后，BCP+BQ-123组痛行为学出现了“V”字型变化，表现为NSF在鞘内注射后0～90min内急剧下降，90min时达到最低点，90min后开始急剧上升，180min时基本回复至鞘内注射前水平。PWT的变化趋势与NSF完全相反。因此，于鞘内注射后90min时，每组随机选择5只小鼠，处死后取脊髓L4-6节段，采用Western blot法检测磷酸化p-Akt、t-Akt、p-ERK-1/2和t-ERK-1/2水平，并计算p-Akt/t-Akt和p-ERK-1/2/t-ERK-1/2。结果显示，与BCP组和BCP+NS组比较，BCP+BQ-123组小鼠脊髓p-Akt、p-ERK-1/2表达下调，p-Akt/t-Akt和p-ERK-1/2/t-ERK-1/2降低(P＜0.001)。 结论： 第一部分:脊髓ET-1及其受体参与BCP的维持，脊髓Akt和ERK通路在BCP的形成和维持中发挥重要作用。 第二部分:鞘内注射ETAR拮抗剂可能通过抑制脊髓Akt和ERK通路减轻小鼠BCP。