疼痛影响人们生活的各个方面,虽然现代医学取得巨大进步,但是许多慢性痛仍然是医学所面临的重大挑战。在消化系统中,内脏慢性痛主要见于功能性肠病(例如,慢性特发性消化不良,功能性腹痛,肠易激综合症等),其中最常见于肠易激综合症(irritable bowel syndrome,IBS)。目前对内脏痛的研究发现,中枢和外周机制均起重要作用。中枢神经系统中,脑肠轴机制越来越凸显；在外周,免疫机制以及神经-免疫关联在内脏痛发生中发挥重要的作用。缩宫素(oxytocin,OT)是由九个氨基酸组成的神经肽,主要由下丘脑的室旁核和视上核合成。OT在临床上主要用于引产、催产、产后出血以及促排乳。近些年研究表明,OT及缩宫素受体(oxytocin receptor,OTR)在肠道中表达,而且在肠道运动和感觉,肠道炎症的调节,肠粘膜结构功能的维持等方面发挥重要的作用。越来越多的研究证实,在外周器官应用OT(静脉注射、腹腔注射、皮下注射以及结肠灌注),能显著抑制内脏痛的发生。深入研究OT对内脏痛的作用及其机制,可为预防和治疗内脏痛提供新的方法和依据。本研究主要从免疫和神经两方面探讨OT的外周镇痛机制。第一部分：缩宫素对结肠高敏感大鼠肥大细胞脱颗粒的影响及其机制研究目的已有文献报道,OT和OTR在肠道中表达,OT能显著抑制内脏痛及内脏高敏感的发生。然而,机制尚不明确。研究发现,IBS患者腹痛的严重程度及频率与结肠神经周围的肥大细胞数目有关,而且肥大细胞激活通过脱颗粒并释放炎性介质,增强肠神经以及背根神经节(dorsal root ganglion,DRG)神经元的兴奋性,从而导致内脏高敏感。本研究的目的是探讨OT对肥大细胞脱颗粒的作用及其机制,以期揭示OT抑制内脏痛的外周免疫机制。方法通过免疫荧光实验和蛋白免疫印迹(Western Blot)实验,检测OTR在肥大细胞的表达。给予大鼠结肠灌注三硝基苯磺酸(2,4,6-trinitrobenzene sulfonic acid, TNBS),来诱导结肠高敏感动物模型,采取结肠灌注OT的方法研究OT对结肠高敏感大鼠的作用。使用甲苯胺蓝标记大鼠结肠组织切片中的肥大细胞,观察肥大细胞的数目和脱颗粒情况。肥大细胞激活后释放的组胺含量通过酶联免疫吸附测定(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)试剂盒进行测定。运用全细胞膜片钳技术记录肥大细胞的膜离子流。通过钙成像设备检测肥大细胞内钙离子Ca2+的变化。结果1.0TR在肥大细胞上的表达免疫荧光实验证实,OTR在人和大鼠结肠组织的肥大细胞上表达。溃疡性结肠炎患者以及TNBS诱导的内脏高敏感模型大鼠的结肠组织中OTR表达阳性的肥大细胞比例均显著升高。OTR也表达于人肥大细胞株-1(human mast cell line-1,HMC-1)和小鼠肥大细胞瘤细胞株(mouse mastocytoma cell line,P815)。2.0T对肥大细胞脱颗粒的影响OT能显著抑制TNBS诱导的结肠高敏感模型大鼠结肠肥大细胞脱颗粒。经OT灌肠的TNBS模型大鼠结肠切片中脱颗粒肥大细胞的百分数(53.5%,38/71),显著低于TNBS模型大鼠(81.9%,59/72)。3.0T对肥大细胞脱颗粒时释放组胺的影响采用化合物48/80(compound 48/80,C48/80)诱导P815细胞脱颗粒,释放组胺,10-6M OT预处理细胞后,C48/80诱导P815细胞释放组胺的含量明显降低。4.0T对肥大细胞内向电流的影响用全细胞膜片钳记录的方法来测定OT对C48/80诱导HMC-1细胞和P815细胞产生内向电流的作用。在电压钳模式下,细胞被钳制在-60 mV,用C48/80持续作用HMC-1细胞或者P815细胞,两种细胞均产生明显的内向电流。OT预处理两种细胞后,C48/80诱导细胞产生的内向电流均明显减小5.0TR拮抗剂和一氧化氮合酶(nitrio oxide synthase,NOS)抑制剂对0T作用的影响用OTR的阻断剂阿托西班(atosiban)或者非选择性NOS抑制剂NG-Methyl-L-arginine acetate salt(L-NMMA)预处理后,OT对C48/80诱导P815细胞组胺释放的抑制作用被显著逆转,OT对C48/80诱导HMC-1细胞和P815细胞内向电流的抑制作用同样被显著逆转。6.0T对肥大细胞内钙离子的影响用Fura-2作为钙离子的荧光染料,用钙成像设备分别记录340 nm和380 nm激发出的发射光强度值F340和F380,以F340/F380的比值来体现胞内钙离子的水平。不同浓度的OT作用HMC-1细胞或者P815细胞后,细胞内钙离子浓度呈剂量依赖性增高。结论1.肥大细胞上表达OTR,溃疡性结肠炎患者以及TNBS诱导的结肠高敏感模型大鼠的结肠组织中表达OTR的肥大细胞比例均显著增高。2.外源性OT可抑制结肠高敏感大鼠的结肠肥大细胞脱颗粒,进而发挥对结肠高敏感性的抑制作用。3.外源性OT可能通过Ca2+-NOS信号通路抑制肥大细胞脱颗粒。第二部分：缩宫素对正常大鼠背根神经节神经元兴奋性的影响及其机制研究目的OT在中枢神经系统中发挥着重要的镇痛作用。然而,OT在外周的镇痛作用虽然也有报道,但机制不清。本研究的目的是探讨OT对DRG神经元电生理特性的影响,以期揭示OT镇痛的外周神经系统机制。方法急性分离DRG神经元并培养。通过钙离子成像技术,检测细胞内钙离子的变化。运用全细胞膜片钳技术,记录DRG神经元的电生理特性。免疫荧光实验用于检测OTR和神经型一氧化氮合成酶(neuronal nitric oxide synthase,nNOS)在DRG神经元中的表达及分布。采用免疫荧光实验和硝酸还原酶法检测DRG神经元内一氧化氮(nitric oxide,NO)的含量。结果1.OT对DRG神经元兴奋性的影响OT能够明显降低小型DRG神经元(直径20-27μM)的兴奋性,这可能跟OT使外向电流增大,引起细胞膜超极化有关。OT作用小型DRG神经元后,能够引发动作电位的阈刺激强度显著增大,而且同等强度的刺激下(正常情况下2倍或者3倍阈刺激强度)引发动作电位的数量明显减少。此外,OT可使电压诱导的外向电流显著增大,并可引起细胞膜超极化。2.nNOS抑制剂对OT引起DRG神经元超极化的影响用选择性的nNOS抑制剂N-Propy1-L-arginine(NPLA)预处理细胞,可以明显降低OT引起的DRG神经元超极化。3.OT对DRG神经元胞内NO含量的影响免疫荧光和硝酸还原酶法监测NO的方法均显示,OT能够显著提高大鼠急性分离的DRG神经元和DRG组织内NO含量。用选择性的nNOS抑制剂NPLA预处理细胞,可以明显逆转OT引起的大鼠DRG组织内和急性分离的DRG神经元胞内NO含量的升高。4.OTR和nNOS在痛觉相关性DRG神经元上共表达免疫荧光实验发现,大于85% IB4标记的痛觉相关性神经元上,同时表达OTR和iNOS。5.三磷酸腺苷敏感性钾通道(adenosine triphosphate sensitive potassium channel,KATP)的阻断剂对OT电生理作用的影响KATP的阻断剂格列本脲(glibenclamide)明显减弱OT引起的大鼠DRG神经元超极化和外向电流增大的效应。6.OT对DRG神经元胞内钙离子的影响OT可以引起小型DRG神经元胞内钙离子剂量依赖性的增加。结论1.OTR和nNOS在IB4标记的痛觉相关性DRG神经元上共表达。2.OT能够引起小型DRG神经元细胞膜超极化并显著降低其兴奋性,进而发挥外周镇痛作用。3.OT可能通过激活DRG神经元内Ca2+/nNOS/NO/KATP信号通路,引起细胞膜超极化。